鸭坦布苏病毒E蛋白功能的研究进展

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)病是由DTMUV引起以病毒性脑炎(雏鸭、育成鸭)及产蛋下降(产蛋鸭)为主要特征的传染性疾病,该病的暴发和传播给水禽养殖业造成了巨大的经济损失。包膜蛋白E(Envelope,E)作为DTMUV关键的免疫原性蛋白,在介导病毒与宿主细胞融合、侵入等方面发挥作用。文章总结了近年来DTMUV E蛋白结构特点、关键毒力位点、潜在抗原表位、蛋白互作及生物制品等最新研究进展,以期为鸭坦布苏病毒病的特异性诊断、疫苗研究和抗病毒药物的设计提供参考。

MAPREC技术检测Sabin株脊髓灰质炎病毒的基因突变率并评价疫苗神经毒力

目的:采用MAPREC技术检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(s IPV)生产收获液中病毒神经毒力决定位点的基因突变并评估疫苗神经毒力。方法:采用MAPREC技术用CY5荧光标记引物替代同位素标记检测疫苗株SabinⅠ、Ⅱ型及PfizerⅢ型疫苗病毒收获液及毒种的神经毒力决定位点的突变率,并与猴体神经毒力比较;采用MAPREC技术检测在不同培养温度、传代的次数、降低病毒接种的感染复数(MOI)时病毒各位点突变率变化。结果:MAPREC方法检测显示,本研究收集的病毒收获液的突变率符合猴体神经毒力检测结果;当病毒培养条件发生改变导致突变率增加后,MAPREC检测出的神经毒力决定位点的突变率也同样增加。结论:MAPREC技术可用于检测Sabin株脊髓灰质炎病毒的基因突变率,并评价疫苗的神经毒力。

登革4型病毒Ban18原株及其减毒株的分子特征研究

目的从分子水平上探讨登革4型病毒Ban18-30减毒株的毒力相关位点和减毒机制。方法Ban18原株及Ban18-30减毒株在Vero细胞中培养增殖,收集病毒液,经RNA抽提后RT-PCR扩增C、prM、E、NS1和3′、5′端核苷酸片段并测序,比较分析结果,研究两株病毒的分子特征。结果RT-PCR成功扩增出目的片段,对两株病毒部分基因测定序列后进行对比分析,两株病毒间在C111位和E155位各有1个氨基酸残基发生变化,在3′UTR的219位发生核苷酸改变。结论从分子水平证明两株病毒确为DEN-4型病毒,某些基因位点的变化与Ban18-30株病毒毒力减弱有关,其中E155位的突变可能关系最大。

珠三角地区鸭坦布苏病毒的全基因序列测定与分析

【目的】了解2010年以来分离于珠三角地区鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu virus，DTMUV）GDNS2010．1、GDNS2010．2、GDZQ2012、GDPY2013株的分子特征．【方法】参考GenBank收藏的DTMUVJS804株，共设计合成11对特异性引物，扩增了4株病毒的全基因序列片段．【结果和结论】4株病毒全长约为10990bp，无Ploy（A）尾结构，仅含有1个大的ORF，共编码3426个氨基酸，5′非编码区（5′UTR）各含有94hp．在3′非编码区（3′UTR），GDNS2010．1、GDNS2010．2毒株在103395～103411bp处缺失10个碱基．联合前期试验已测定的2株病毒序列（GDHZ2012．1、GDHZ2012．2），用DNAstar和MEGA6．0序列分析软件将6株病毒同GenBank收藏的国内的其他坦布苏病毒株比对，发现核酸序列相似性在98％以上，与Ntaya病毒和Sitiawan病毒相似性较大，相似性都在73％左右；与西尼罗河病毒、日本乙型脑炎病毒、黄热病毒等相似性皆低于63％．6株病毒囊膜蛋白E核酸序列相似性为97．5％～99．9％，推导氨基酸序列相似性在97％以上，其中同一地区分离的毒株相似性最高，达99．9％；在囊膜蛋白E154位存在一潜在的糖基化位点Asn-Try-Ser，在E蛋白结构域Ⅱ第E289位，极性带正电荷的Lys变为极性带负电荷的Glu，推测这一位点可能为病毒的毒力位点．

EV71毒力相关位点研究进展

肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）是引起手足口病（hand—foot—and—mouth disease，HFMD）的主要病原体之一，主要通过粪口途径以及与患者的病变部位、唾液等直接接触而感染，感染对象主要为5岁以下的低龄儿童。其所引起的临床症状以温和的HFMD为主，表现为手、

登革2型病毒乳鼠神经毒力相关位点的研究

pDVWS501为含有登革2型病毒全长cDNA的质粒,可利用感染性转录体技术恢复为有活力的病毒MON501.将MON501注射乳鼠脑内可引发脑炎症状,其E蛋白的62,203位分别为Glu,Asn.采用OL-PCR方法把pDVWS501 E62位氨基酸突变为Lys,得到质粒TB62;E203位氨基酸突变为Asp,得到质粒TB203.将pDVWS501,TB62和TB203酶切后体外转录得到全长登革2型病毒转录体,应用电穿孔技术转染BHK-21细胞,7天后收毒.RT-PCR证实有登革2型病毒存在,接种C6/36细胞,3～5 d可使其产生典型病变.测定突变区域的序列,结果表明得到了恢复病毒MON501和E62,E203位点突变的重组病毒HFT62,HFT203.3株病毒均在其基因组5’端加“G”,3’端则与登革2型病毒野生株相同.分别将3株病毒稀释至105～102TCID50,经脑内途径注射1日龄乳鼠,发现与MON501相比,HFT62,HFT203在同一稀释度发病乳鼠的个数减少,发病时间延长且差异显著,表明E62,E203可能是登革2型病毒乳鼠神经毒力相关位点.

乙型脑炎病毒E蛋白毒力关键位点的正向验证

目的将乙型脑炎野毒株SA14囊膜蛋白(envelope,E)氨基酸残基107位点(E107)和138位点(E138)突变为乙型脑炎减毒株SA14-14-2的相应位点,正向分析两个氨基酸位点突变在乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)减毒中的作用。方法通过融合PCR方法分别扩增含有E107(1296-T)、E138(1389-A)、E107+138(1296-T/1389-A)突变位点的PCR片段,KasⅠ和BglⅡ酶切后替换乙型脑炎强毒SA14的嵌合病毒SA14-14-2/SA14的相应区域,构建3个突变株病毒的全长克隆,转染BHK21细胞获得突变株病毒。测定并比较3个突变株和嵌合病毒SA14-14-2/SA14、疫苗株SA14-14-2的蚀斑大小及细胞增殖特征、小鼠脑内神经毒力、小鼠皮下感染入脑能力,分析E107、E138位点突变对JEV的减毒作用。结果测序结果表明成功构建了3株突变株病毒,其中E107单位点突变对小鼠脑内神经毒力和皮下感染入脑能力无显著改变,蚀斑形态和细胞增殖能力也无明显变化。E138单位点突变及E138和E107双位点突变使病毒脑内神经毒力和皮下感染入脑能力急剧降低,其中E138和E107双位点突变使病毒皮下感染入脑能力完全消失,并且E138单位点突变以及E138和E107双位点突变病毒蚀斑较疫苗株SA14-14-2和嵌合病毒SA14-14-2/SA14明显偏小,但增殖能力有明显升高。结论 E138位点突变对JEV SA14的减毒起关键作用;在E138位点突变的前提下,E107位点与E138位点有显著的协同作用。

国内C4基因型EV-A71结构蛋白VP1区第98和145位点分子进化特征的分析

目的 分析国内C4基因型肠道病毒A71型(enterovirus A71,EV-A71)结构蛋白VP1区第98和145位点的分子进化特征。方法 构建国内C4型EV-A71 VP1序列数据库,采用选择压力位点分析、易突变位点熵值分析、氨基酸多样性分析3种方法分析国内C4基因型EV-A71不同进化分支的结构蛋白VP1区第98和145位点分子进化的特征,并结合手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)暴发前后及临床轻重症信息进行分析。结果 国内C4基因型EV-A71流行进化过程,发生了从C4b到C4a-1,再到C4a-2三个进化分支的优势替换,且不同进化分支VP1的选择压力位点不同。VP1区第98和145位点是国内C4型EV-A71进化过程中发生改变的关键氨基酸位点,与病毒毒力和传播特征紧密相关。VP1区第98和145位点氨基酸组合类型主要包括98E145E(EE)占89.24%、98K145E(KE)占6.78%、98E145G(EG)占1.76%、98E145Q(EQ)占1.66%。其中,EE为最常见类型,而KE型与临床重症发生显著相关(P<0.001)。结论 国内EV-A71优势流行毒株仍为C4a-2基因型,结构蛋白VP1区第98和145位点可能是重要的病毒毒力相关位点。

人类肠道病毒71型的研究进展

肠道病毒71型是引起手足口病的主要病原体之一，其感染还可导致多种与神经系统相关的疾病，致残率及病死率较高。近年来，EV71感染在全球范围呈现上升趋势，2008年我国也有较大规模流行。本文对EV71的病原学特征、流行病学特征以及相关最新研究进展等方面作一综述。