单增李斯特菌毒力因子及调控机制研究进展

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种革兰氏阳性食源性致病菌,能在低温、高温、高渗透压等多种不利条件下生长存活。在宿主体内,单增李斯特菌首先寄生于胃肠道,随后穿过肠道屏障,再通过血液传播到靶器官引发系列疾病,整个过程与单增李斯特菌独特的毒力因子及调控机制密切相关。该文首先回顾整理了单增李斯特菌在感染期间关键毒力因子的主要作用及目前新进展,介绍了毒力调控因子(Prf A)和转录调控因子(σ~B),着重讨论了调控因子在宿主外环境和内环境的相互作用,最后对目前新的毒力调控因子进行归纳总结,为全面理解单增李斯特菌的感染机制和进一步开展精准防控提供一定参考。

单核细胞增生李斯特菌PrfA蛋白转录调控毒力基因表达的分子机制

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes LM)属于典型的细胞内寄生革兰氏阳性菌,是WHO公布的四大食源性致病菌之一。LM不仅是人畜共患传染病李斯特菌病(listeriosis)的主要病原菌,也是研究胞内感染和细胞介导的免疫应答的模式细菌。绝大多数LM毒力基因的转录表达受到PrfA蛋白的调控。本文简单介绍了LM侵染宿主细胞必需的毒力基因及其产物;重点对毒力基因调节蛋白PrfA的结构和功能,PrfA调节毒力基因表达的主要方式最新进展进行了综述和讨论。

淬灭酶AiiO-AIO6酶学性质及对嗜水气单胞菌毒力因子的表达调控

将N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因(aiiO-AIO6)插入表达载体pET28a构建了原核表达载体pET28a/aiiO-AIO6。转化大肠杆菌后筛选具有活性的重组子并对纯化的目的蛋白AiiO-AIO6的酶学性质进行了研究,同时研究了纯化的酶液对嗜水气单胞菌ATCC7966溶血素(Hemolysin,Hem)、细胞肠毒素(Cytotonic enterotoxin,Ast)、胞外蛋白酶(Extracellular protease,Ep)、丝氨酸蛋白酶(Serine protease,Sp)及磷脂酶Pho(Phospholipase A1,Pho)等5个毒力因子表达的影响。结果表明,pET28a/aiiO-AIO6在大肠杆菌中大量表达N-乙酰高丝氨酸内酯酶,纯化后的N-乙酰高丝氨酸内酯酶的最适作用条件为pH 8.0,30℃,在pH 6.0～11.0的范围内能够稳定的存在,在80℃条件下保温30 min后酶活力能够维持在65%以上;且该酶对多种金属离子、化合物和中性蛋白酶都具有很好的抗性;该酶对多种底物都具有一定的降解作用;以3-oxo-C8-HSL为底物时的Km值为0.015 mmol/L;比活力为583.33 U/mg。N-乙酰高丝氨酸内酯酶在培养8 h及12 h时对嗜水气单胞菌5个毒力因子的表达量都具有明显的下调趋势(P<0.05)。本实验通过测定AiiO-AIO6的酶学性质及证明AiiO-AIO6可以通过降解嗜水气单胞菌产生的信号分子来抑制其毒力因子的表达,从而为将其应用于水产环境及致病性嗜水气单胞菌的生物防治奠定理论基础。

肺炎链球菌毒力因子ClpP蛋白酶的体外表达及纯化

目的构建ClpP原核表达载体,获取原核表达的ClpP蛋白分子。方法分离培养TIGR4型肺炎链球菌,获取其染色体DNA,采用基因体外重组的方法将完整的ClpP读码框克隆到pET-32a原核表达载体,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Western blot鉴定,镍柱纯化并透析复性,真空冷冻干燥保存。结果测序结果证实克隆的基因与GenBank中的序列相符,Western blot证实获得了ClpP融合蛋白。结论获得了高表达的重组抗原蛋白,经镍柱纯化后纯度可达90%以上。

近平滑念珠菌临床分离菌株毒力因子差异表达研究

目的比较近平滑念珠菌临床分离株毒力相关因子天冬氨酸蛋白酶和生物膜形成及其基因表达的差异。方法采用基因测序及微卫星分型方法,对临床真菌感染患者分离的近平滑念珠菌进行鉴定,检测各菌株产生分泌型天冬氨酸蛋白酶及生物膜形成的能力,比较各菌株生物膜形成相关基因BCR1、EFG1、HWP1及天冬氨酸蛋白酶毒力基因SAPP1、SAPP2、SAPP3表达的差异。结果共收集8株临床分离的近平滑念珠菌,经基因鉴定均为基因Ⅰ型。微卫星分型结果显示,8株临床菌株分为4个微卫星型别,G1、G2、G3菌株为不同型别,分别分离自甲患者的尿、经外周静脉置入中心静脉导管(PICC)和血;J1、J2、J3、J4、J5菌株为同一型别,分离自乙患者不同时期血标本。8株临床菌株均能形成生物膜,生物膜形成能力均高于近平滑念珠菌标准菌株ATCC 22019,其中G1、G3和J5菌株生物膜形成能力强,J1、J2、J3、J4菌株生物膜形成能力中等,G2菌株生物膜形成能力弱。8株临床分离菌株均分泌天冬氨酸蛋白酶,酶体外表达水平均高于近平滑念珠菌标准菌株ATCC 22019,G3、G1、G2菌株分别为低表达、中表达、高表达,酶体外表达水平比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);J1、J5菌株为中表达,J2、J3、J4菌株为高表达,中表达菌株与高表达菌株比较,差异有统计学意义(P<0.05)。甲、乙患者分离的各菌株生物膜形成基因BCR1、EFG1、HWP1表达水平均增加,其中甲患者G1菌株EFG1基因表达水平高于G2菌株(P<0.05),乙患者分离的菌株BCR1、EFG1、HWP1基因表达水平差异无统计学意义。甲、乙患者分离的各菌株天冬氨酸蛋白基因SAPP1、SAPP2、SAPP3表达水平均增加,其中G1菌株的SAPP1和SAPP2表达水平高于G2、G3(均P<0.05),乙患者SAPP1、SAPP2、SAPP3基因表达水平差异无统计学意义。结论近平滑念珠菌临床分离株生物膜形成和天冬氨酸蛋白酶产生能力均高于标准菌株,分离自不同标本的菌株毒力因子表达具有差异性,不同时期分离的菌株毒力因子表达差异不明显。患者可能存在同一时期多部位感染不同MT型别近平滑念珠菌的情况。

线粒体蛋白质翻译延伸因子(TUFM)在不同毒力新城疫病毒感染的鸡胚成纤维细胞中的表达水平

为研究线粒体蛋白质翻译延伸因子Tu(TUFM)在不同毒力新城疫病毒(NDV)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中表达水平的变化,运用比较蛋白质组技术分析感染了NDV的CEF差异表达的蛋白点。与24 h的阴性对照组相比,感染NDV后24 h时TUFM表达量在毒力最弱的WX-10-07-Pi感染组中显著升高;毒力最强的JS-5-05-Go引起宿主表达TUFM量随感染时间增加逐渐增强。推测TUFM的表达水平与NDV毒力强弱具有一定相关性。

钙离子拮抗药调控群体感应系统对铜绿假单胞菌毒力因子表达的影响

目的:考察钙离子拮抗药(CCB)硝苯地平、维拉帕米、地尔硫[艹卓]调控铜绿假单胞菌(PA)群体感应系统对毒力因子表达的影响。方法:倍比稀释法测定CCB对PA的最小抑菌浓度(MIC)和生长抑制;测定CCB对PA绿脓毒素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶表达的影响。结果:硝苯地平、维拉帕米、地尔硫[艹卓]对PA均有抑制作用,硝苯地平的MIC_(50)为64μg·ml^(-1),MIC90为256μg·ml^(-1),MICr_(ange)为64~256μg·ml^(-1);维拉帕米的MIC_(50)为128μg·ml^(-1),MIC90为512μg·ml^(-1),MICr_(ange)为128~512μg·ml^(-1);地尔硫[艹卓]的MIC_(50)为256μg·ml^(-1),MIC90>512μg·ml^(-1),MICr_(ange)≥256μg·ml^(-1)。生长抑制实验中,与对照组相比,硝苯地平、维拉帕米、地尔硫[艹卓]浓度≥16μg·ml^(-1)可显著抑制PA的生长(P<0.05或P<0.01),随着浓度的增加,抑制作用逐渐增强,其中硝苯地平的抑制作用最强。毒力因子表达实验中,与对照组相比,硝苯地平、维拉帕米、地尔硫[艹卓]浓度≥16μg·ml^(-1)可显著影响绿脓毒素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶的表达(P<0.05或P<0.01),且随着浓度的增加,影响作用增强,其中硝苯地平的影响作用最强。结论:CCB可抑制PA生长,调控PA的群体感应系统从而影响毒力因子的表达,可作为抗菌增效的潜在药物。

人参皂苷Rg_3对肿瘤血管生长调控因子蛋白表达抑制作用的研究

目的探讨中药单体人参皂苷20(R)Rg3对肿瘤血管生长调控因子(VEGF,bFGF,MMP2)蛋白表达的抑制作用。方法进行人肺腺癌细胞株A549、人脐静脉血管内皮细胞HUVEC304细胞株培养、10-6mol·L-1浓度Rg3药物干预72h,采用免疫组化、基因芯片技术,检测上述因子蛋白表达阳性率和灰度变化以及A549细胞基因的差异表达情况。结果Rg3干预后,A549细胞VEGF蛋白阳性表达率显著降低(P=0.03),VEGF,Flt,KDT以及MMP2蛋白阳性表达的强度较对照组均有显著下降(P<0.05),内皮细胞VEGF,Flt和KDT蛋白阳性表达的灰度较对照组均有显著下降(P<0.05)。基因芯片差异性表达显示其中14个基因下调,10个基因上调。结论Rg3可显著抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的血管生长调控因子蛋白表达,通过不同靶点作用于肿瘤细胞影响肿瘤新生血管的生成。

猪链球菌2型毒力因子部分片段的克隆与表达

根据猪链球菌2型(Streptococcussuistype2)胞外蛋白因子(extracellularfactorprotein,EF)的基因(epf)序列,设计合成一对引物,以猪链球菌2型江苏分离株SS2-H的基因组为模板,扩增epf基因1585-2547位序列,进行T/A克隆,转化入宿主菌DH5α中。提取阳性克隆质粒进行双酶切并纯化,将目的片段向克隆到表达载体pET-32a中组氨酸的下游,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导可表达分子量约为53000的融合蛋白。免疫转印分析表明,该融合蛋白具有EF的抗原表位。

环丙沙星联合乳铁蛋白多肽嵌合体对铜绿假单胞菌毒力因子的影响

目的研究环丙沙星(CIP)、乳铁蛋白多肽嵌合体(LFchimera)单用及二者联合对铜绿假单胞菌毒力因子生成的影响。方法以铜绿假单胞菌野生菌株PAO1为实验菌株,分为对照组(无任何干预的铜绿假单胞菌野生菌株PAO1),CIP(0.04μg/mL)组,LFchimera(0.25μmol/L)组,LFchimera(1μmol/L)组,CIP(0.04μg/mL)+LFchimera(1μmol/L)组,分别测定毒力因子绿脓菌素的浓度(氯仿萃取法)、弹性蛋白酶(弹性蛋白-刚果红法)、胞外蛋白水解酶(偶氮酪蛋白法)。结果和对照组比较,CIP组,LFchimera(0.25μmol/L)组,LFchimera(1μmol/L)组,CIP(0.04μg/mL)联合LFchimera(1μmol/L)组的绿脓菌素浓度下降,弹性蛋白酶和蛋白水解酶活性降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);CIP组和LFchimera(0.25μmol/L)组比较,绿脓菌素浓度、弹性蛋白酶和蛋白水解酶活性的差异均无统计学意义(均P>0.05);LFchimera(1μmol/L)组绿脓菌素浓度、弹性蛋白酶和蛋白水解酶活性较CIP组和LFchimera(0.25μmol/L)组降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);CIP(0.04μg/mL)联合LFchimera(1μmol/L)组和各单独用药组比较,绿脓菌素浓度下降,弹性蛋白酶和蛋白水解酶活性降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论亚抑菌浓度的CIP和LFchimera都对铜绿假单胞菌毒力因子(绿脓菌素、弹性蛋白酶和蛋白水解酶)的生成有抑制作用,随着LFchime-ra浓度的提高这种抑制作用加强,而CIP联合LFchimera能进一步增强这种抑制作用,说明两者在抗铜绿假单胞菌毒力因子方面有协同作用。

杀香鱼假单胞菌Ⅲ型分泌系统转录调控蛋白ExsA突变株的构建及其对大黄鱼的毒力特征分析

杀香鱼假单胞菌是大黄鱼内脏白点病的致病菌,感染该菌常会导致养殖大黄鱼很高的死亡率和严重的经济损失。病原株NB2011编码典型的Ⅲ型分泌系统,可能是该菌重要的毒力因子,ExsA是控制此分泌系统表达的重要调控蛋白。为确认ExsA在NB2011致病过程中的作用,开发有效疫苗,实验采用双交换同源重组法构建了ExsA内部序列被卡那霉素基因替换的突变株,检测突变株与野生株对鼠巨噬细胞J774的黏附、内化和胞内增殖特性,并比较对大黄鱼的毒力变化,同时,通过透射电子显微镜观察人工感染后大黄鱼内脏组织的病理变化。研究表明,巨噬细胞对突变株的内化率降低,内化的细菌在12 h内被清除,野生株在内化后虽然一段时间内数量稍有下降,12~24 h期间数量急剧上升;突变株对大黄鱼的96 h LD_(50)为2.59×10~7/mL,比野生株高数百倍;电镜切片中未观察到组织内有菌体的存在,表明突变株的毒力明显减弱,可以作为弱毒疫苗的开发对象。

口腔白念珠菌耐药性及毒力因子表达水平相关性研究

目的了解口腔白念珠菌分泌型水解酶、生物膜和菌丝相等毒力因子的体外表达水平及其耐药性,并分析两者的相关性。方法分别采用牛血清白蛋白平板、卵黄琼脂平板和三丁酸甘油脂平板检测口腔白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)、磷脂酶(PL)和脂肪酶(Lip)的活性;采用结晶紫法检测其生物膜的形成,采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测菌丝壁蛋白1(HWP1)基因的表达;检测白念珠菌对常用抗真菌药物的耐药性。结果80%的菌株高产分泌型SAP,98%的菌株高产PL,78%的菌株Lip产量中等,无菌株高产Lip;50株菌株均能形成生物膜,其中30株(60%)生物膜形成能力强;SAP和PL的体外表达水平呈正相关(P<0.05),其他毒力因子之间均无相关性;耐药株与敏感株的毒力因子体外表达及HWP1表达之间没有显著性差异。结论大部分口腔白念珠菌高表达SAP和PL,中等表达Lip,生物膜形成能力强,SAP和PL的体外表达水平呈正相关,口腔白念珠菌的毒力与耐药性之间没有显著相关性。

李斯特菌毒力因子及其调控机制的研究进展

李斯特菌是一种重要的人兽共患病病原菌,其致病性与毒力因子密切相关,作者对其毒力基因及调控机制的研究进展做一简要综述。

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达、纯化及免疫活性鉴定

目的表达、纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC并对其免疫活性进行鉴定。方法将含有ipaC基因的pET32a-ipaC表达质粒载体转入大肠杆菌BL21(λDE3)中表达,表达产物进行SDS-PAGE鉴定,并采用QIAexpressionistTM蛋白纯化系统纯化IpaC蛋白;用纯化的蛋白免疫动物获得抗血清,Western-blot检测抗原的免疫活性。结果诱导后的表达产物经SDS-PAGE发现有一相对分子量约为63000的条带,其含量约占总蛋白量的11%,对融合蛋白进行纯化纯度可达90%以上,抗His的抗体Western-blot分析,发现特异性区带出现在63000u处,证明该蛋白是所要表达的融合蛋白,制备的免疫血清可与IpaC发生特异免疫反应。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定、高效地表达毒力蛋白IpaC,且纯化后的蛋白具有免疫活性。

布鲁菌外膜蛋白及毒力因子研究进展

布鲁菌细胞膜的基本结构包括脂多糖和外膜蛋白,与细菌的毒力及免疫原性相关。文章描述了布鲁菌外膜蛋白分子结构的最新进展。该菌的外膜蛋白由第一组、第二组和第三组外膜蛋白构成。第一组外膜蛋白对维持布鲁菌外膜蛋白的结构起重要作用;第二组包括36 ku^38 ku外膜蛋白,为膜孔蛋白,由Omp2a和Omp2b基因编码,其中38 ku蛋白基因可能是一个与毒力相关的基因;第三组外膜蛋白包括31 ku和25 ku两个相关的蛋白,具有重要的免疫功能。31 ku蛋白属膜孔蛋白,25 ku蛋白还与毒力有关。文章也介绍了布鲁菌毒力因子研究的最新进展。

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达与纯化

目的表达和纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC,研究福氏志贺菌的致病机制。方法将含有ipaC基因的pET32a-i-paC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21(λDE3),在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,对诱导后的表达产物进行SDS-PAGE鉴定,并采用QIA expressionistTM蛋白纯化系统来纯化目的蛋白。结果诱导后的表达产物经SDS-PAGE发现有一相对分子质量约为63 000的条带,其含量约占总蛋白量的11%,以350 mmol/L咪唑洗脱液洗脱,目的蛋白纯度可达90%以上。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定、高效地表达目的蛋白,QIA-expressionistTM蛋白纯化系统是一种简便、高效的纯化系统,可获得高纯度的目的蛋白。

霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR的PCR扩增及克隆

为了构建霍乱弧菌和杜氏利什曼原虫双价口服活疫苗候选株 ,作者采用 PCR对霍乱弧菌毒力表达调控基因 tox R进行扩增及克隆 ,并对霍乱弧菌 tox R基因进行限制性酶切分析。结果显示 :7株霍乱弧菌均扩增出 1 .3kb的 tox R基因片段 ,tox R基因中部含有 Eco R 酶切位点 ,再将 tox R基因克隆在质粒 p AT1 5 3上 ,对所获的重组质粒 pt R4进行限制性酶切分析 ,证实质粒 pt R4插入的 1 .3kb的 DNA片段为 tox

GFP用于单核细胞增生李斯特菌PrfA调控毒力基因actA转录表达的研究

PrfA是单核细胞增生李斯特菌(LM)中迄今为止发现的惟一个调控绝大多数毒力基因转录表达的蛋白因子。为了研究PrfA转录调控毒力基因表达的分子机制,将无启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因与毒力基因actA的启动子融合,连接到穿梭载体pLSV16质粒上,构建成表达融合载体pLSV16-PactA-gfp,然后将其电转化入LM野生株P14、PrfA高表达突变株P14a和prfA基因等位缺失突变株A42中表达。利用荧光显微镜和荧光酶标仪检测上述3株细菌中绿色荧光蛋白的不同表达强度,从而评价actA基因依赖于PrfA的转录活性强弱。结果显示,绿色荧光蛋白在P14a中发出的荧光强度最高,P14次之,A42最弱,两两比较均有显著差异(P<0.01),表明毒力基因actA的转录水平高低与PrfA的活性成正相关,其转录表达依赖于PrfA的调控;该试验同时也显示GFP能方便、有效地用于研究PrfA调控LM不同毒力基因的转录表达水平。