基于牛流行热病毒G蛋白的免疫胶体金检测方法的建立

【目的】建立牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus,BEFV)的免疫胶体金检测方法,为牛流行热(BEF)诊断提供研究基础。【方法】构建原核表达载体pET32a-BEFV-G,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行表达,对诱导成功后的表达产物进行纯化和SDS-PAGE、Western blotting鉴定。以纯化后的蛋白作为特异性抗原包被检测线,以链球菌G蛋白作为金标抗原,与金纳米颗粒结合后标记在金标垫上,用羊抗鼠IgG作为质控线,通过优化不同的反应条件,建立检测BEFV的免疫胶体金检测方法,并对试纸条进行敏感性、特异性和重复性检测。【结果】SDS-PAGE结果显示,在IPTG终浓度为0.75 mmol/L时,37℃诱导8 h的条件下重组BEFV G蛋白表达量最大,且以包涵体形式表达,分子质量约为46 ku。Western blotting结果显示,浓缩纯化后的重组BEFV G蛋白具有较好的反应原性,可作为包被抗原用于免疫胶体金试纸条的建立。在质控线包被的抗体羊抗鼠IgG浓度为2 mg/mL,BEFV G蛋白包被浓度为0.6 mg/mL,喷金量为2.5μL/cm的条件下,3~5 min就可完成检测。制备的试纸条有较高的敏感性和特异性,血清稀释倍数为40倍的时候显色接近消线,且试纸条仅与BEFV阳性血清发生显色反应,与牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)等其他病毒阳性血清均无交叉反应,阳性血清样本重复性试验证明试纸条的重复性较高,成功建立了免疫胶体金检测方法。【结论】本研究以原核表达的G蛋白为抗原成功制备了检测BEFV的新型免疫胶体金试纸条,该检测试纸条特异性强、稳定性好,适合用于临床快速检测BEF。

流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和寨卡病毒四重LuminexxTAG检测方法的建立与应用

【目的】黄病毒科虫媒病毒引起的人畜共患传染病对我国畜牧业及公共卫生造成严重影响。虫媒病毒种类多且感染症状相似,临床监测工作繁重,建立4种危害严重的黄病毒科虫媒病毒快速、高通量检测技术为其诊断和流行病学监测提供技术支撑。【方法】利用Luminex xTAG技术,针对流行性乙型脑炎病毒(JEV)5'UTR、西尼罗病毒(WNV)5'UTR及部分C基因、黄热病毒(YFV)5'UTR和寨卡病毒(ZIKV)NS5基因保守区,设计4对特异性引物并对引物进行TAG和Biotin修饰,以标准毒株为模板,进行多重PCR扩增;将扩增产物与带有反向TAG序列的不同编号荧光MagTAG磁珠、链霉亲和素R-藻红蛋白进行核酸杂交反应,利用Luminex 200系统检测磁珠荧光信号和藻红蛋白荧光信号,对病原进行分类和定量检测。【结果】建立了能特异性检测JEV、WNV、YFV和ZIKV的四重Luminex xTAG方法,其最优引物工作浓度为0.5、0.5、0.75、0.5µmol/L;杂交工作体系为磁珠工作液20μL、PCR扩增产物5μL、SAPE报告缓冲液75μL;杂交温度为37℃,杂交时间为30 min,pH值为8.0;该检测方法特异性好且不与登革病毒等其他虫媒病毒发生交叉反应。重复性试验结果表明,Luminex xTAG方法的批内变异系数为2.50%~5.63%,批间变异系数为3.61%~12.50%。四重Luminex xTAG方法对JEV和ZIKV的检测限为1×10^(4) copies/μL,对WNV和YFV的检测限为1×10^(3)copies/μL,其检测WNV、YFV和ZIKV的灵敏度较常规PCR高10~100倍。用Luminex xTAG方法和RT-qPCR方法检测209份临床样品和模拟样品,JEV、WNV、YFV、ZIKV符合率为100%。【结论】建立的四重Luminex xTAG方法具有高通量、高特异性和灵敏度、成本效益高的优点,可为虫媒病毒临床诊断和流行病学监测提供一种高通量技术手段。

黄热病毒的一步RT-PCR法检测

自不同稀释度的乳鼠脑病毒悬液中制备总RNA,在自制缓冲液条件下,进行一步RT-PCR法检测.对一步RT-PCR法与常规RT-PCR的敏感性进行比较,并且以基孔肯亚病毒和登革1-4型病毒RNA为模板进行特异性观察.结果表明,本研究建立的一步RT-PCR法可检出2.8×103PFU的病毒,敏感性比常规RT-PCR法高10倍,且与基孔肯亚病毒、登革病毒1-4型无交叉反应,具有良好的特异性和敏感性,适用于黄热病毒的病原学检测.

云南省思茅地区乙型脑炎病毒及黄热病毒的分子流行病学监测

2009年至2010年,在云南省思茅地区普文镇、思茅区、震东乡、六顺乡、勐旺乡等地共采集17880只蚊子(分为91管),其中库蚊16500只(83管),按蚊1380只(8管)。采用RT-PCR方法,对91管蚊虫样本进行流行性乙型脑炎病毒NS1基因及黄热病毒E基因片段扩增,回收阳性PCR产物,并进行测序和遗传进化分析。结果表明,思茅地区库蚊乙型脑炎病毒检测阳性率为18.1%(15管/83管),黄热病毒检测阳性率为15.7%(13管/83管),思茅地区按蚊乙型脑炎病毒检测阳性率为25%(2管/8管),黄热病毒检测阳性率为12.5%(1管/8管)。克隆的流行性乙型脑炎病毒NS1基因及黄热病毒E基因与JEV和YFV参考株进行序列比对,与乙型脑炎病毒参考株同源性为88.3%～90.7%。监测结果显示,思茅地区蚊子JEV和YFV带毒率均较高,表明当地两种虫媒病毒病流行风险高。

犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异性引物对及TaqMan MGB探针;经反应条件优化,建立了检测CDV和CPV的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法检测CDV、CPV的标准曲线线性相关系数(R^2)分别为0.997和0.993,最低检出限均为10拷贝/μL,具有较高的灵敏性;对犬副流感病毒等4种病原对照和阴性对照均未出现扩增,特异性良好;CDV、CPV标准品批间试验结果显示,该方法具有很好的重复性;对48份临床疑似CDV或CPV感染样品检测结果显示,14份为CDV阳性,19份为CPV阳性,4份为CDV/CPV双阳性,与CDV H基因、CPVVP2基因测序结果符合率为100%。本研究建立的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点,可用于临床CDV/CPV病毒感染各个时期的快速鉴别检测。

黄热病毒NS1蛋白的制备及免疫原性鉴定

目的原核系统克隆表达黄热病毒(yellow fever virus,YFV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1),鉴定其免疫原性。方法以YFV-17D疫苗株为模板,常规分子生物学方法构建pQE30-YFV NS1表达载体,原核表达纯化YFVNS1重组蛋白;免疫印记、免疫荧光和酶联免疫吸附实验验证其免疫原性。结果成功构建重组质粒pQE30-YFV NS1,制备纯化可溶性YFV NS1蛋白;该重组YFV NS1蛋白与登革病毒、黄热病毒、乙脑病毒、西尼罗河病毒免疫小鼠腹水及寨卡病毒NS1、YFV NS1蛋白免疫小鼠血清均发生反应,重组YFV NS1蛋白免疫小鼠血清与YFV感染细胞超声上清也发生反应。结论获得高纯度YFV NS1重组蛋白,且具有较好的免疫原性,含天然NS1蛋白表位,为基于NS1黄热病毒早期抗原诊断方法和蛋白功能研究奠定基础。

犬瘟热病毒SH202003株全基因组序列分析

为了解上海地区犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)遗传变异情况,本研究采用首尾重叠的11对特异性引物,对CDV上海株SH202003进行RT-PCR扩增,将扩增片段进行反复测序,序列拼接后最终获得了SH202003株全基因组序列,应用Lasergene 7.0和Mega 6.0软件对全基因及H基因进行序列分析,并构建系统进化树。结果显示,SH202003株基因组全长为15690 bp,编码6种结构蛋白(N、P、M、F、H和L),H和L基因间隔序列为CUA,L和5′端尾随序列为CAA,与Hebei株核苷酸和氨基酸相似性最高,达到98.6%和96.6%,与疫苗株核苷酸相似性在92.2%~94.3%,氨基酸相似性只有82.7%~87.0%;全基因进化树中,SH202003株与流行野毒株在同一分支,与疫苗株在不同的分支;H基因同样与Hebei株亲缘关系最近,核苷酸和氨基酸相似性分别为98.7%和99.5%,与疫苗株Snyder Hill、CDV3、Convac及Onderstepoort亲缘关系较远;SH202003株处于Asia-1型分支,属于Asia-1型强毒株;SH202003株具有9个潜在N-糖基化位点,与强毒株Hebei株一致。研究表明,上海株SH202003属于CDV强毒株,为Asia-1型,其H基因序列相对保守,具有9个潜在N-糖基化位点,但是全基因序列存在较多突变,与疫苗株的匹配度较差,可能是免疫犬依然发生犬瘟热的主要原因。

成都地区宠物犬感染犬瘟热病毒和犬呼吸道冠状病毒的分子流行病学调查

为了解成都地区宠物犬犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬呼吸道冠状病毒(canine respiratory coronavirus,CRCoV)的感染情况,本试验应用RT-PCR对采自成都地区8家动物医院共计420份出现呼吸道症状的宠物犬鼻腔棉拭子样本进行分子检测。结果发现,从420份样本中,检出213份CDV阳性,检出率为50.71%;检出247份CRCoV阳性,检出率为58.81%;CDV和CRCoV混合感染的检出率为41.19%。表明成都地区宠物犬感染CDV和CRCoV较为严重,且二者混合感染率较高。宠物犬CDV和CRCoV的检出率与年龄、性别、品种、季节和免疫状况等因素的关系存在不同程度的差异。其中,1~3月龄幼犬检出率最高,分别为74.40%和79.20%;纯种犬的检出率较其他犬种高,分别为59.37%和62.22%;春季CDV的检出率较高,为56.19%,而冬季CRCoV的检出率较高,为67.59%;未免疫犬的检出率较高,分别为64.42%和63.46%。该研究丰富了成都地区宠物犬CDV和CRCoV的流行病学资料,为该地区宠物犬CDV和CRCoV的诊断及防控提供了基本数据。

重组黄热病毒E蛋白结构域Ⅲ作为亚单位疫苗的抗原性和免疫原性

目的:表达纯化黄热病毒(YFV)囊膜蛋白(E蛋白)结构域Ⅲ,研究其作为亚单位疫苗预防YFV、日本脑炎病毒(JEV)感染的可能。方法:扩增YFVE蛋白结构域Ⅲ(YFDⅢ)的cDNA片段333bp,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-YFDⅢ,转化感受态大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组YFDⅢ;用纯化的YFDⅢ免疫新西兰兔和BALB/c鼠,检测相关抗体滴度。结果:在大肠杆菌中可溶性表达了YFDⅢ融合蛋白,表达量约占菌体蛋白的50%;Western印迹及ELISA分析表明,纯化的YFDⅢ具有良好的抗原性和免疫原性;利用纯化的YFDⅢ免疫新西兰兔,获得了高达1∶4×105滴度的抗YFV抗体和1∶2×104滴度的抗JEV抗体;利用纯化的YFDⅢ免疫BALB/c鼠,获得了1∶7×104滴度的抗YFV抗体和1∶2×103滴度的抗JEV抗体。结论:重组YFDⅢ有较好的免疫原性,具有开发成亚单位疫苗的潜能。

黄热病毒与甲型流感病毒及其分型集合检测芯片的初步研制

目的:研制黄热病毒与流感病毒及其分型集合检测芯片。方法:设计并合成60mer寡核苷酸(Oligo)探针用于制备检测芯片。提取黄热病、甲型流感病毒核酸,以限制性显示技术进行扩增标记,完成杂交后对芯片进行扫描和数据分析。结果:Oligo探针与相应的荧光标记样本杂交后,大部分能检测出阳性荧光信号,而空白对照和阴性对照均为阴性信号。结论:寡核苷酸芯片技术可应用于多种病毒的检测及分型,从而为多种病毒感染的早期鉴别诊断提供科学依据。

貉源犬瘟热病毒的分离鉴定及其H基因的序列分析

为了研究我国貉源犬瘟热病毒(CDV)的流行、遗传变异性,试验从某养殖场选取5只疑似患犬瘟热病死貉的肝脏、肺脏、脾脏、肠等脏器,利用Vero细胞分离出1株病毒,通过免疫荧光、RT-PCR等方法鉴定为CDV,命名为HLJ(11),利用其RNA为模板,采用RT-PCR扩增血凝素(H)基因,进行序列测定与分析。结果表明:分离株HLJ(11)的H基因序列与HeB(07)1、SD(09)3、SD(07)1同源性最高,分别为99.9%、99.7%、99.6%,与Strain CDV 3、Convac vaccine strain的同源性最低,为91.4%;遗传进化分析显示,分离株HLJ(11)为Asia-Ⅰ型。

牛流行热病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

牛流行热(BEF)是由牛流行热病毒(BEFV)引起的一种急性、热性传染病,是一种牛非接触性的虫媒病毒性疾病。该病发生于夏末秋初,给养殖业造成了重大损失。目前,国内外并没有针对该病的血清学检测方法。本研究针对BEFV的免疫保护基因——G基因(包含有G1基因的片段),设计引物,构建了表达载体,表达了该基因,利用此蛋白作为抗原,建立了牛流行热病毒抗体间接ELISA检测方法。本方法为牛流行热病毒的检测提供了有效的检测手段,也为我国制定牛流行热病毒的防控战略提供一定的理论依据。

嵌合病毒技术在黄热病毒属病毒研究中的应用

嵌合病毒技术是用于RNA病毒研究的一个重要技术,近十年来在黄热病毒属病毒的研究中,构建了一些型内及型间的嵌合病毒,不仅有利于该属病毒的分子机制研究,更重要的是研制出一些新型减毒活疫苗。本文简单介绍该技术的原理、构建、影响因素、应用前景等。

抗犬瘟热病毒VHH抗体噬菌体库的构建与筛选

为构建特异性犬瘟热病毒(CDV)的纳米抗体库,获得抗CDV的VHH抗体,本试验利用CDV免疫羊驼,四免后采集外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录为cDNA,利用巢式PCR扩增纳米抗体序列。将目的片段连接至pComb3x噬菌体展示载体,并电转至TG1宿主菌,挑取40个克隆进行菌液PCR验证,随机挑选13个阳性单克隆进行测序,计算抗体库库容量,加入辅助噬菌粒拯救获得的噬菌体展示抗体库。经过3轮淘选,富集对CDV结合力高的噬菌体。利用毕赤酵母系统表达两株结合力高的噬菌体,经Ni柱纯化后,利用ELISA进行噬菌体结合力的鉴定。结果表明,四免后羊驼血清效价达1∶25000,达到建库要求,构建的噬菌体展示文库库容量达3.41×109 PFU。经过3轮淘选,特异性抗体库经稀释100倍后,ELISA检测仍为阳性,表明特异性结合CDV的噬菌体得到明显的富集。ELISA结果表明,两株纯化的纳米抗体与CDV的反应性显著高于对照组。以上结果提示,本研究成功筛选出2株特异性结合CDV的VHH抗体,为VHH抗体在犬瘟热的诊断和治疗方面的应用奠定了基础。

嵌合犬瘟热病毒H基因的重组狂犬病病毒的构建及免疫原性研究

【目的】构建表达犬瘟热病毒(CDV)血凝素蛋白H基因的重组狂犬病病毒(RABV),并研究其生物学特性及免疫原性。【方法】在RABV HEP-dG株基因组G与L基因之间插入CDV H基因,构建重组全长cDNA质粒pHEP-dG(H)。将pHEP-dG(H)与辅助质粒共同转染BHK细胞,拯救携带CDV H基因的重组RABV HEP-dG(H)。将重组病毒接种BHK细胞,分析病毒的扩散能力;将重组病毒接种小鼠,分析病毒的致病性和免疫原性。【结果】RT-PCR及直接免疫荧光显示,传至第3代的病毒仍能检测到H基因,表明CDV H基因已成功插入RABV基因组中,并在HEP-dG(H)中稳定遗传和正确表达。HEP-dG(H)在BHK细胞中的生长曲线与HEP-dG毒株相似,病毒滴度在96 h达到峰值,但HEP-dG(H)的滴度在每个时间点略低于HEP-dG。以感染复数(MOI)为0.005感染BHK细胞,HEP-dG(H)的扩散能力比HEP-dG毒株低。HEP-dG(H)与HEP-dG对6周龄成年小鼠均不致死,但HEP-dG(H)对成年小鼠体重的影响弱于HEP-dG。HEP-dG(H)与HEP-dG均能诱导小鼠产生抗RABV的中和抗体,免疫后7 d抗体已达到保护水平(0.5 EU/mL);此外,HEP-dG(H)可诱导产生CDV中和抗体。HEP-dG(H)与HEP-dG免疫小鼠3周后,均能抵御RABV标准攻毒毒株CVS-24的攻击。【结论】本研究成功构建重组RABV HEP-dG(H),其具有良好的免疫原性和安全性,可作为RABV-CDV新型二联基因工程候选疫苗。

犬瘟热病毒检测技术的研究进展

犬瘟热是由犬瘟热病毒(CDV)感染引起的一种传染性强、范围广、致死率极高的动物疾病,易感动物主要是犬科、猫科和鼬科动物,感染后不仅给宠物饲养和特种经济养殖带来巨大经济和精神损失,还会引起社会恐慌。因此,研制一种快速、准确的检测方法具有重要意义。文章从犬瘟热病毒的流行病学、发病机理及实验室检测CDV经常采用技术,包括血清学检测方法、分子生物学检测技术进行详细阐述。

稳定表达犬瘟热病毒Nectin4受体的Vero细胞系构建

为提高病毒的分离效率,本试验设计构建了能够表达犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)上皮细胞Nectin4受体的Vero细胞。为增加蛋白定位的准确性并易于鉴定,使用Igκ信号肽替换原有信号肽序列并添加了HA标签,在Nectin4 ORF后串联IRES-Puro序列并连入pCI-Neo真核表达载体,得到完整的转染载体pCI-N4。不同浓度嘌呤霉素孵育Vero细胞得到最小筛选浓度为6μg/mL。pCI-N4重组质粒转染Vero细胞后使用6μg/mL嘌呤霉素筛选,5~7 d后出现具有抗性的细胞簇,有限稀释法连续单克隆纯化3代后获得稳定表达的细胞系。构建细胞系传代至15代能检测到Nectin4 mRNA转录,Western blotting检测筛选细胞得到约60 ku目的蛋白表达,间接免疫荧光检测显示纯化细胞蛋白表达丰度高且表达均一,激光共聚焦观察Nectin4目的蛋白定位于细胞膜,说明筛选的Vero-Nectin4细胞系能够稳定表达,表达蛋白能够满足作为CDV受体的结构要求。临床CDV阳性病料经研磨滤菌处理后接种构建细胞系能够产生典型的合胞体细胞病变,Vero对照组盲传3次未有病变。分离毒株TICD50=10-5.9/0.1 mL。构建的Vero-Nectin4细胞系可用于CDV分离。

利福平抗黄热病毒感染的效果及初步机制

目的检测利福平抗黄热病毒(YFV)感染的效果并初步探索其机制。方法用不同浓度(0.04、0.2、1、5、25、125、625μmol/L)的利福平处理人肝癌细胞Huh-724 h,通过CCK-8检测利福平的细胞毒性并计算其细胞半数毒性浓度(CC50)。YFV感染Huh-7细胞的同时加入不同浓度(0.04、0.2、1、5、25μmol/L)的利福平,检测其抗YFV感染的剂量效应,并计算IC50。YFV感染Huh-7细胞的同时加入5μmol/L利福平,孵育不同时长(2、4、8、12、24 h),检测其抗YFV感染的时间效应。YFV感染Huh-7细胞后,在感染的不同时间段(2、4、6、8、12 h)加入25μmol/L利福平(药物作用时间2 h,病毒感染2 h),检测其抗YFV感染最显著的起效阶段。利用病毒结合实验、内吞荧光标记实验评价利福平对YFV入侵靶细胞的影响。结果利福平细胞毒性较弱(CC50为176.9μmol/L),抑制YFV作用显著(IC50为1.868μmol/L,P<0.01);动力时间窗、结合和内吞实验表明,利福平能抑制YFV结合、入侵靶细胞(P<0.01),但不影响YFV的内吞过程。此外,利福平在感染后期的复制阶段也有一定的抑制效果(P<0.01)。结论利福平可抑制YFV感染靶细胞,作用机制主要通过在病毒感染早期的入侵阶段阻断病毒结合靶细胞。

广州口岸入境外籍人员黄热病毒核酸及抗体水平分析

目的了解广州口岸入境外籍人员中黄热病毒核酸及该人群黄热病毒抗体水平,为研究黄热病输入我国的风险及口岸黄热病防控工作提供依据。方法对来自黄热病高风险区,离开高风险区<6天,无症状且未能出示黄热病疫苗接种记录的外籍人,开展流行病学调查,进行黄热病毒核酸、抗体检测及数据分析。结果在2017-2019年间,结合流行病学调查随机抽选共839份目标人群的血清样本列入研究组,用荧光定量PCR法进行黄热病毒核酸检测,结果均为阴性;同时使用间接免疫荧光法(IFA)进行黄热病毒抗体IgG检测,结果显示阳性率为56.73%。其中年龄、人员类别和来源国是IgG抗体阳性率的影响因素。结论我国存在黄热病输入风险,对来自黄热病高风险区的人员开展黄热病毒核酸及抗体检测有助于口岸黄热病的防控工作;来自黄热病高风险区的外籍人员,黄热病毒抗体阳性率随年龄增加而升高。

基于黄热病毒编码蛋白的靶向药物研发研究进展

黄热病毒(YFV)属于黄病毒科黄病毒属,是一类有包膜的单正链RNA病毒。尽管疫苗能有效预防YFV感染,但普及率较低,加之缺乏有效抗病毒药物,YFV仍周期性暴发。YFV基因组编码的病毒蛋白在其感染的各个阶段均发挥重要作用,因此研发靶向YFV蛋白的治疗药物是提高黄热病治疗效果、降低病死率的有效措施。本文简要介绍了YFV基因组编码的病毒蛋白的结构和功能,并综述了针对这些靶点研发抗YFV药物的进展和发展前景,为防治YFV感染提供参考。