富马酸与肉桂醛联用调节产肠毒素型大肠杆菌诱导猪肠上皮细胞氧化应激的分子机制

本试验旨在研究富马酸(FA)与肉桂醛(CA)联用调节产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)K88诱导猪肠上皮细胞IPEC⁃J2氧化应激的分子机制。试验选用IPEC⁃J2细胞建立氧化损伤模型,用不同浓度FA和CA处理IPEC⁃J2细胞12和24 h,并用CCK⁃8法检测细胞活力,确定最佳处理浓度和时间;以最佳处理浓度的FA和CA预处理细胞,ETEC K88感染细胞3、6、12和24 h,检测其活菌黏附率,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞因子含量和抗氧化指标,并用实时荧光定量PCR(RT⁃qPCR)测定热休克蛋白70(Hsp70)和核因子-κB(NF⁃κB)信号通路相关基因mRNA相对表达量。结果表明:1)FA和CA的最佳处理浓度分别为1.00 mg/mL和1.00μL/mL,最适培养时间为12 h。2)添加FA和CA可有效抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,当ETEC K88感染细胞3 h时其黏附率显著下降(P<0.05),6、12和24 h时极显著下降(P<0.01)。3)添加FA和CA可极显著降低ETEC K88感染细胞中促炎性细胞因子白细胞介素-8(IL⁃8)和肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)含量(P<0.01),极显著提高抗炎性细胞因子白细胞介素-10(IL⁃10)和转化生长因子-β(TGF⁃β)含量(P<0.01)。4)ETEC K88通过激活NF⁃κB信号通路诱导IPEC⁃J2细胞氧化损伤,添加FA和CA可上调Hsp70 mRNA相对表达量并抑制NF⁃κB信号通路缓解IPEC⁃J2细胞氧化应激。5)添加FA和CA可显著提高ETEC K88感染细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH⁃Px)活性(P<0.05),极显著降低丙二醛(MDA)含量(P<0.01)。综上所述,FA与CA联用可调节炎性细胞因子和氧化应激蛋白平衡并抑制ETEC K88黏附IPEC⁃J2细胞,其可能是通过上调Hsp70抑制NF⁃κB信号通路,增强IPEC⁃J2细胞的抗氧化和抗炎能力,从而缓解ETEC K88诱导的IPEC⁃J2细胞氧化应激。

猪胸膜肺炎放线杆菌山东分离株的血清型与Apx毒素型研究

从山东省不同地区采集的85份具有严重呼吸道症状病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌(APP)的分离鉴定,采用凝集试验和PCR方法对分离菌株进行血清型和APX毒素型的检测.结果从山东省不同地区分离到20株分属5个血清型的APP,其中,血清7型6株、血清5型5株、血清3型4株、血清4型3株、血清8型2株,血清7型、5型为优势血清型.不同地区分离的APP血清型不同,同一地区也存在不同的血清型.PCR检测结果表明,不同血清型的APP共含有4种溶血毒素(Apx),其中,血清3、4、8型APP含ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ,血清5型含Apx Ⅰ、ApxⅡ和ApxⅣ,血清7型含ApxⅡ和ApxⅣ,20株APP分离株均含有ApxⅡ和ApxⅣ两种毒素,表明野毒株的血清型与毒素基因的种类有一定的相关性.毒素序列分析结果表明,相同毒素型APP,其毒素基因序列的同源性在99.5%～100%之间,与血清型无关.致病性试验结果表明,所含毒素类型不同的APP对小白鼠的致病性不同,其中含Apx Ⅰ和ApxⅡ的血清5型APP毒力最强.该研究为猪传染性胸膜肺炎的免疫预防、亚单位疫苗的研制及基于ApxⅣ的PCR检测奠定了基础.

牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定和某些生物学特性的研究

从西藏地区腹泻死亡牦牛中分离出一株肠毒素型大肠杆菌并对其某些生物学特性进行了研究。结果表明 ,该菌在形态特征、培养特性和生化特性方面与大肠杆菌基本一致。血清学试验表明 ,该菌株O抗原属O14 8,K88、K99、987P单因子血清均不能凝集本菌 ;该菌不产生溶血素 ;对绵羊、豚鼠、马、鸡的红细胞表现强凝集 ,而K88、K99、987P抗血清均不能抑制其它对绵羊、豚鼠、马、鸡红细胞的凝集 ;该菌株在营养肉汤中经 37℃ ,4 8小时培养表达菌毛 ;肌肉接种兔、腹腔接种小鼠均具有高致病性 ;乳鼠胃内投服试验和兔回肠结扎试验证明 ,该菌能产生热稳定肠毒素和热敏性肠毒素 ;分离菌株对恩诺沙星、环丙沙星、阿莫西林、羧苄青霉素等高度敏感 ,而对链霉素、四环素。

青岛地区规模化兔场产气荚膜梭菌流行株毒素型、遗传多样性和耐药性研究

为了解青岛地区产气荚膜梭菌流行株近几年出现的毒素型、遗传多样性和耐药性变化,本研究选取2006年和2012年从青岛规模化兔场分离的产气荚膜梭菌菌株各15株,分别采用多重PCR、ERIC-PCR和药敏纸片法对分离菌株的毒素型、遗传多样性和耐药性进行检测。结果表明:2006年分离的产气荚膜梭菌流行株均为A型,β2毒素阳性菌为2株(13.33%),而未检测到肠毒素和NetB毒素;2012年分离的15株产气荚膜梭菌流行株中A型14株、C型1株,β2毒素阳性菌为6株(40%),同样未检测到肠毒素和NetB毒素。将30株产气荚膜梭菌流行株通过ERIC-PCR方法分为14个亚型,其中2006年分离株分布于8个亚型,V型为主要流行型;2012年分离株也分布于其中8个亚型,主要流行型为Ⅲ型和Ⅺ型。产气荚膜梭菌2012年流行株比2006年流行株对先锋霉素、强力霉素、万古霉素、青霉素的耐药率大幅度提高。本研究结果显示:自2006年以来,青岛规模化兔场产气荚膜梭菌流行株在毒素基因、遗传多样性和耐药性上均发生了较大变化,这一结果为今后该地区兔场产气荚膜梭菌病的防控提供了依据。

SDS-PAGE法检测产气荚膜梭菌毒素型研究

为了探索一种快速、准确检测产气荚膜梭菌毒素型的方法，以便有效预防控制该病的流行和发生，利用SDS-PAGE方法，对通过EusA鉴定的20株（A型16株、C型3株和D型1株）德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株，以及通过Multiplex-PCR鉴定的57株山东省疫区产气荚膜梭菌分离株外毒素蛋白的相对分子质量进行测定，以确定毒素的种类，进而确定菌株的毒素型。结果表明，产气荚膜梭菌标准株、德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株、山东省疫区产气荚膜梭菌分离株粗提外毒素的质量浓度分别为3．261，2．238～3．333，1．451～3．109mg／mL，精提外毒素的质量浓度分别为0．803，0．521～O．999，0．530～0．812mg／mL。SDS-PAGE法检测的20株德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株中A型17株、C型2株、D型1株，与EuSA检测结果的符合率为95．0％；SDS-PAGE检测的57株山东省疫区产气荚膜梭菌分离株全部是A型，与Multiplex-PCR检测结果的符合率为100％。说明应用SDS-PAGE方法对产气荚膜梭菌的检测结果与ELISA方法的检测结果有一定的差异性，与Multi-plex-PCR方法的检测结果一致。

毒素型及免疫型大鼠纤维化肝组织中金属蛋白酶组织抑制因子定位及表达差异

目的探讨人血白蛋白免疫诱导型及四氯化碳(CCl4)毒素诱导型所致大鼠肝纤维化模型肝组织中金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)定位及表达状态的差异。方法分别以20%人血白蛋白进行免疫攻击和CCl4毒素攻击大鼠,造模结束后对大鼠肝组织进行HE、VG染色及电镜观察;同时研究TIMP1、TIMP2蛋白及mRNA定位及表达状态。结果造模结束后,免疫诱导型模型肝组织病理改变具有进行性加重趋势,TIMP1、TIMP2mRNA及蛋白表达强度高、持续时间长;而毒素诱导型模型具有TIMP1、TIMP2mRNA及蛋白表达强度弱、肝纤维化持续时间短等特点。免疫诱导实验组肝脏中TIMP1、TIMP2相关抗原表达在肌成纤维细胞、成纤维细胞,以汇管区及纤维间隔中最明显,阳性信号位于细胞胞质中,未见细胞核表达。原位杂交检测结果亦相似。结论毒素诱导型肝纤维化模型自然吸收较快,不利于抗肝纤维化药物疗效的观察;免疫诱导型肝纤维化模型自然吸收时间较慢,且在造模结束后1～3个月有逐渐加重趋势,有利于抗肝纤维化药物疗效观察及肝纤维化机制研究。

牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定和某些生物学特性的研究

从西藏地区腹泻死亡牦牛中分离出 1株肠毒素型大肠杆菌并对其某些生物学特性进行了研究。结果表明 ,该菌在形态特征、培养特性和生化特性方面与大肠杆菌基本一致。血清学试验表明 ,该菌株O抗原属O14 8,K88,K99,987P单因子血清均不能凝集本菌 ;该菌不产生溶血素 ;对绵羊、豚鼠、马、鸡的红细胞表现强凝集 ,而K88,K99,987P抗血清均不能抑制其对绵羊、豚鼠、马、鸡红细胞的凝集 ;该菌株在营养肉汤中经 37℃ ,4 8h培养表达菌毛 ;肌肉接种兔、腹腔接种小白鼠均具有高致病性 ;乳鼠胃内投服试验和兔回肠结扎试验证明 ,该菌能产生热稳定肠毒素和热敏性肠毒素 ;分离菌株对恩诺沙星、环丙沙星、阿莫西林、羧苄青霉素等高度敏感 ,而对链霉素、四环素、土霉素等表现耐药性。

一株不表达K88、K99、987P粘附因子牦牛肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定

从西藏地区腹泻死亡牦牛中分离出一株肠毒素型大肠杆菌。该菌在形态特征、培养特性和生化特性方面与大肠杆菌基本一致。血清学试验表明 ,该菌的O抗原属O148,K88、K99、987P单因子血清均不能凝集本菌。在MSHA反应中 ,本菌能凝集绵羊、豚鼠、马、鸡的红细胞 ,而K88、K99、987P抗血清均不能抑制其对绵羊、豚鼠、马、鸡红细胞的凝集。腹腔接种对小白鼠具有高致病性。乳鼠胃内投服试验和兔回肠结扎试验证明 ,该菌能产生热稳定肠毒素和热敏性肠毒素。总之 ,该菌是一株不表达K88、K99、987P的、能产生ST和LT的肠毒素型大肠杆菌。

由产毒素型大肠杆菌引起的一例疑似霍乱腹泻的调查报告

产毒素型大肠杆菌(ETEC)是引起小儿急性腹泻及旅游者腹泻的主要原因。其致病机理主要为ETEC可以产生肠毒素即热敏肠毒素(LT)和热稳定肠毒素(ST),从而激活肠粘膜细胞上的鸟核苷酸环化酶,改变肠液和电介质的转运而引起分泌进。ST和LT基因探针虽已用于该菌的快速诊断,但在基层条件的限制,有时应急情况下,一时不能解决问题。

仔猪肠产毒素型大肠杆菌的分离与鉴定

从腹泻死亡仔猪分离出一株大肠埃希氏杆菌，经家兔回肠结扎试验证明能产生热敏肠毒素（ＬＴ）；药敏试验表明对ＳＭＺ＋ＴＭＰ、链霉素、丁胺卡那霉素高度敏感，对四环素、氨苄青霉素不敏感；用分离菌株制成灭活油剂苗对８０头怀孕母猪进行免疫接种结果所生小猪在４０ｄ获得１００％保护率。

肠毒素型大肠杆菌F18菌毛对产蛋鸡免疫的原性

提取猪源肠毒素型大肠杆菌(ETEC)标准株和临床分离株F18菌毛,并制备弗氏佐剂苗,分别免疫产蛋母鸡后用间接ELISA法定期检测母鸡卵黄抗体和血清抗体效价.结果表明:无论标准株还是分离株,F18菌毛对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,卵黄抗体效价最高可达1∶25600,血清抗体效价高于卵黄抗体效价,最高可达1∶51200.

对FC株猪源性肠毒素型大肠杆菌致病因子的研究

FC菌株是一株从腹泻仔猪粪便中分离的肠毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)。在MRHA反应中,本菌能凝集人O型、豚鼠、马、绵羊、牛、鸡和兔的红细胞,对人O型和豚鼠红细胞有很高的血凝性,血抗K88和K99血清不能抑制其对豚鼠和绵羊红细胞的血凝。在体外小肠上皮细胞吸附试验中,本菌对仔猪小肠上皮细胞具有强烈的吸附作用;透射电镜和扫描电镜观察证实了FC株菌除表面具有一种纤毛样结构外,还能定居在仔猪小肠段。血清学试验结果表明,本菌的O抗原属于O101。K88和987P两种抗血清均不能凝集本菌,而K99和F41抗血清均可凝集。对纯化的FC株菌粘着素抗原作等电聚焦和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果表明,该菌的粘着素是由等电点分别为4.61和9.78,分子量分别为29500和17500的两种蛋白质抗原所组成。此外,用乳鼠胃内投服试验和兔肠结扎试验证明,该菌只产生热稳定肠毒素。总之,本菌是一株能产生ST的K99,F41的肠毒素型大肠杆菌。

我国部分地区猪产气荚膜梭菌流行病学调查及毒素型分析

试验收集了湖南、浙江、福建、广东等4省8市的规模化猪场各阶段猪的粪便样品74份和肠道样品15份,以及现场采集了广州某生猪屠宰场肝脏和肺脏样各30份共计149份样品,对产气荚膜梭菌在猪中的感染情况进行流行病学调查。处理样品后进行产气荚膜梭菌的分离培养,16s rDNA PCR并测序鉴定阳性菌株,后进行毒素型分析。结果表明,猪产气荚膜梭菌的总检出率为20.81%,其中粪样的阳性率为13.51%,肠样的阳性率为33.33%,肺脏和肝脏的阳性率为26.67%;哺乳仔猪和后备母猪的产气荚膜梭菌阳性率分别为22.73%和14.29%;毒素分型结果表明分离到的31株产气荚膜梭菌全部为A型菌株,其中74.19%的菌株携带Cpb2毒素基因。研究结果为猪产气荚膜梭菌的防控提供流行病学数据。

产肠毒素型脆弱拟杆菌促进结直肠癌发生发展的机制研究进展

脆弱拟杆菌是人体肠道常见的革兰阴性专性厌氧菌。根据能否合成分泌脆弱拟杆菌肠毒素,其可分为产肠毒素型脆弱拟杆菌(ETBF)和非产肠毒素型脆弱拟杆菌。ETBF是结直肠相关性疾病中检出率最高的厌氧菌,但由于分离、培养和检测均相对困难,有关ETBF的研究仍较少。随着宏基因组学的兴起,肠道菌群成为研究热点,ETBF的生物学特性和功能得到进一步阐明,其可能对结直肠癌(CRC)的发生发展有积极促进作用,如诱导慢性炎症的发生,激活Wnt/β联蛋白通路促进结直肠细胞的增殖等。因此,探讨ETBF的生物学功能及其在CRC中的作用机制对CRC的筛查和预防尤为重要,未来应对ETBF在CRC病变早期的丰度变化、功能作用以及具体调控机制进行深入研究。

山羊产气荚膜梭菌的分子流行病学调查与毒素型分析

试验采集江苏地区10市肉羊场(山羊)及扬州大学动物医院的山羊新鲜粪便,PCR法对产气荚膜梭菌进行核酸检测,对该菌在肉羊中的感染情况做流行病学调查,对鉴定呈阳性的菌株进行毒素型鉴定。结果表明:临床粪样产气荚膜梭菌的总检出率19.12%,其中健康羊粪样的阳性检出率21.42%,发病羊粪样3.50%;不同地区阳性率有所不同,阳性率最高23.33%。在108株分离到的气荚膜梭菌株中,62.03%为A型株、37.96%为D型、未见B、C、E型。结果提示,被检临床健康肉羊广泛携带产气荚膜梭菌,且大多携带A型菌,少部分携带D型菌。

植物乳杆菌抑制产肠毒素型大肠杆菌诱发猪肠上皮细胞炎症反应的分子机制

本试验旨在研究植物乳杆菌抑制产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)诱发猪肠上皮细胞炎症反应的分子机制。试验利用植物乳杆菌预处理猪肠上皮细胞IPEC⁃J23 h,ETEC刺激细胞1、3、6、12和24 h,收集细胞及其培养上清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清液中白细胞介素-1β(IL⁃1β)、白细胞介素-8(IL⁃8)和肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)的含量,采用实时荧光定量PCR检测细胞中Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)以及NOD样受体3(NLRP3)和NOD样受体6(NLRP6)的表达,采用Western blot检测细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)[p38和细胞外信号调节激酶(ERK)]和核转录因子-κB(NF⁃κB)p65的磷酸化水平以及紧密连接蛋白———闭合小环蛋白-1(zonula occludens⁃1,ZO⁃1)和闭锁蛋白(occludin)的表达。分别采用p38 MAPK抑制剂、ERK⁃MAPK抑制剂和NF⁃κB p65抑制剂处理IPEC⁃J2细胞1 h,再用植物乳杆菌预处理细胞3 h,最后用ETEC处理细胞24 h,收集细胞和培养上清,采用ELISA法检测IL⁃1β、IL⁃8和TNF⁃α含量以及乳酸脱氢酶(LDH)活性。结果表明:1)与ETEC处理相比,植物乳杆菌预处理能够极显著降低ETEC感染12~24 h细胞产生IL⁃1β、IL⁃8和TNF⁃α的含量(P<0.01),显著或极显著提高ETEC感染3~12 h细胞中TLR2、TLR4、NLRP3和NLRP6的mRNA相对表达量(P<0.05或P<0.01),极显著降低ETEC感染24 h细胞中TLR2和NLRP3的mRNA相对表达量(P<0.01),极显著降低ETEC感染3~6 h细胞中p38 MAPK和NF⁃κB p65的磷酸化水平(P<0.01),显著或极显著提高ETEC感染6~24 h细胞中ZO⁃1和occludin的表达量(P<0.05或P<0.01)。2)与ETEC处理相比,抑制剂和植物乳杆菌共同作用能够极显著降低ETEC感染细胞产生IL⁃1β、IL⁃8、TNF⁃α的含量和LDH的活性(P<0.01),植物乳杆菌单独作用也可以极显著降低ETEC感染细胞产生LDH的活性(P<0.01),并且信号通路抑制剂对植物乳杆菌调控部分促炎性细胞因子的产生有协同作用。综上所述,植物乳杆菌可以通过致弱p38 MAPK磷酸化和阻断NF⁃κB信号通路的活化而降低炎症相关因子的产生,从而表现出提高猪肠上皮细胞完整性的潜力。

貉产肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定

致病性大肠杆菌能产生一种或多种肠毒素,称为毒素型大肠杆菌(ETEC)。ETEC是导致人畜腹泻的主要致病菌,借助于所产生的菌毛抗原黏附于动物小肠粘膜定居并产生作用于肠壁的外毒素称为肠毒素。主要有两类肠毒素:一类是不耐热性肠毒素,即热敏感性肠毒素(LT);另一类是耐热性肠毒素,即热稳定性肠毒素(ST)。仔猪的黄、白痢。

产肠毒素型大肠杆菌致死白眉长臂猿的病例分析

1发病情况2014年7月初,德宏州野生动物收容救护中心饲养的4只白眉长臂猿先后出现以腹泻为主的传染病症,自第一例发病开始到最后一例康复,共经历了10d,白眉长臂猿发病率为100%,经过诊治1只死亡,3只痊愈,经对患病白眉长臂猿病症进行分析,发现产肠毒素型大肠杆菌是导致白眉长臂猿死亡的主要原因。在白眉长臂猿发病后,我中心对圈舍进行大规模消毒,中心内其他灵长类未出现类似病症。