霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的构建霍乱毒素A亚基基因(ctxA)的融合表达载体,并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基(CTA)免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法以霍乱弧菌DNA为模板,PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-CTA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET-ctxA,经SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。

霍乱弧菌CT毒素环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

目的将一种新颖的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应用于霍乱弧菌毒素基因ctxA的快速检测。方法针对霍乱弧菌毒素基因ctxA设计6条特异性引物(两条内引物、两条外引物和两条环引物)进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。结果最佳反应时间为60 min,反应温度为65℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅含毒素基因ctxA的霍乱弧菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为68 fg和42 cfu/ml。对模拟样品进行直接检测,检测限为72 cfu/g。结论该方法检测霍乱弧菌毒素基因ctxA特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1 h即可完成,适合基层检验部门使用。

广东省霍乱病例与环境来源霍乱弧菌的耐药性和分子分型研究

目的比较分析广东省霍乱病例及环境来源O1/O139群霍乱弧菌抗生素敏感性和分子分型特征。方法选取2006-2007年广东省霍乱病例及相关来源、环境(珠江水体和海水产品)来源的O1/O139群霍乱弧菌。采用血清学、药物敏感性试验和分子生物学方法,研究不同来源的霍乱弧菌在菌型分布、药物敏感性、毒素基因携带以及分子分型方面的异同。结果2006-2007年,广东省共分离各类来源O1/O139群霍乱弧菌170株。其中,病例及相关来源菌株37株,环境来源菌株133株(海水产品来源37株、珠江水体96株)。两种来源菌株的菌型构成均以O1群E l Tor稻叶型为主;病例及相关来源菌株以产毒株为主,ctxA毒素基因携带率(83.8%)显著高于环境菌株(4.5%);药物敏感性试验显示,以产毒株为主的病例及相关来源菌株对萘啶酸和复方新诺明的耐药率(78.8%,78.8%)高于以非产毒株为主的环境来源菌株(50.6%,13.9%,P<0.05)。环境来源菌株对多西环素的耐药率(17.7%)高于病例及相关来源菌株(0%,P<0.05)。O139群菌株对氨苄西林的耐药率(70%)高于稻叶型和小川型菌株(8.9%,0%,P<0.01)。脉冲场凝胶电泳(PFGE)聚类分析显示,O139群霍乱弧菌产毒株之间,O1群霍乱弧菌流行株之间以及其他的O1/O139群霍乱弧菌之间,PFGE型别表现为明显的遗传多样性。结论广东省O1/O139群霍乱弧菌来源复杂多样,霍乱防控形势严峻,需要密切注意菌株型别变异情况及菌株变异趋势。