霍乱毒素B亚基基因具有自己的启动子

本研究发现并证实霍乱毒素Ｂ亚基基因上游ＸｂａＩ～ＣｌａＩ限制性片段内存在具有启动子活性的序列；在该启动子作用下，霍乱毒素Ｂ亚基表达水平可达２００ｍｇ／Ｌ，氯霉素乙酰基转移酶基因表达水平随培养条件不同在０．３～１０ｍｇ／Ｌ之间，大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的表达量达４１００单位／ｍｌ。在该启动子的控制下霍乱毒素Ｂ亚基基因可以高效表达，该启动子的存在可能是霍乱毒素操纵子中霍乱毒素Ｂ亚基表达量是Ａ亚基的６倍的原因。

黄曲霉毒素B_1对肉鸭生长、肝组织结构及免疫相关基因表达的影响

本试验旨在研究饲粮黄曲霉毒素B1(AFB1)对肉鸭生产性能、肝组织结构及免疫相关基因白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)表达的影响。试验选用1日龄健康双鬼头肉鸭240羽,随机分为4组,每组6个重复,每个重复10羽。试验期4周(28 d),对照组饲喂基础饲粮,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组饲喂在基础饲粮中分别添加50、100和150μg/kg AFB1纯品的试验饲粮,记录采食量和增重数据,计算生产性能;试验结束时屠宰,取肝脏样品,分别进行切片及实时荧光定量PCR检测分析。结果表明:1)饲粮中添加不同水平AFB1极显著降低了肉鸭的平均日增重和平均日采食量(P<0.01),与对照组相比,3个试验组肉鸭末重分别下降了14.67%(P<0.01)、30.38%(P<0.01)和31.83%(P<0.01),且100、150μg/kg AFB1还极显著增加了料重比(P<0.01),显著增加了死亡率(P<0.05);2)随着AFB1添加水平的增加,肉鸭肝脏组织病变程度逐渐增加,肝脏中IL-2和IFN-γ基因mRNA表达水平呈现不同程度的降低,其中100、150μg/kg AFB1极显著下调了IFN-γ基因mRNA的表达水平(P<0.01)。由此可见,饲粮中添加AFB1可导致肉鸭生产性能下降和肝脏组织结构损伤,并通过下调肝脏中IL-2和IFN-γ基因的表达,改变肉鸭机体的免疫水平。

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄中表达的研究

将霍乱肠毒素 B亚单位 (CT-B)基因及内质网引导序列 (SEKDEL)克隆到质粒 p RTL2和 p BI1 2 1中 ,分别构建植物双元表达载体 p BI-CTB和 p BI-CTBK,CT-B基因由 Ca3 5 S启动子控制表达 .采用叶盘法经根癌农杆菌介导转化番茄 (金丰 1号 ,Jinfeng1 ) ,各表达载体得到一批转基因植株 .经 PCR和 Southern blot分析表明 CT-B基因整合到了番茄基因组中 ;ELISA和 Western blot分析表明 p BI-CTB和 p BI-CTBK的转基因植株能够有效表达 CT-B多肽 ,分别占番茄叶片可溶性蛋白的 0 .0 5 5 %和 0 .0 84% .

PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因

目的 :金黄色葡萄球菌B型肠毒素是污染食品引起食物中毒的主要原因之一 ,针对进出口食品卫生监测的需要 ,研究一种简便、快速、准确的实验方法。方法 :利用聚合酶链反应技术 (PCR)采用特异的模板探针引物进行杂交 ,最后通过电泳技术与阳性对照进行比对 ,来判断阴阳性结果。结果 :本方法检出率高 ,每克样品中有 4个金黄色葡萄球菌即可检出 ,2 4小时即可报告结果。结论 :PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因快速、准确 ,检测周期短 ,既可提高检出率 ,又可节省检测时间。

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄果实中特异性表达及其免疫原性的研究

利用番茄果实特异性启动子-E8启动子,将霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)用根癌农杆菌浸润法转入番茄植株,并使其在果实中特异表达,然后对试验小鼠进行口服免疫,研究转基因番茄果实的免疫原性。结果表明,ctb基因在14株番茄植物基因组中被证实有整合,并在其中2株的番茄果实中有特异性表达,最高表达量分别为455和385 ng·g-1FW,口服免疫后的小鼠血液和肠道粘膜中均检测到抗CTB抗体。表明获得了在番茄果实中特异、高效表达霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)的植物口服疫苗候选植株。

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约 70 0bp的DNA片段 ,将之克隆到pGEM 7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因 ,它含有 717bp(不包括N端81bp的信号肽编码区 ) ,其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体 7ZTS上 ,转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)内。表达的SEB占总蛋白 33.5 %。

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。

变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因转基因黄瓜植株的获得及鉴定

目的:经农杆菌介导将变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因导入黄瓜,获得转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的研究提供实验基础。方法:利用双元载体pCAMBIA2301构建变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合质粒(PAcA-ctxB)的植物表达载体p2355-PAcA-CTB;电转化法导入农杆菌EHA105;采用叶盘转化法转化黄瓜,转基因植物经过卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测目的基因鉴定。结果:成功得到转基因黄瓜植株,卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测证实目的基因PAcA-ctxB已整合至黄瓜基因组中。结论:获得了含有变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因的转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的进一步研究提供了实验基础。

小肠结肠炎耶尔森菌耐热性肠毒素B基因(ystB)初步研究

目的研究小肠结肠炎耶尔森菌的耐热性肠毒素B基因(ystB)的分布特征。方法通过聚合酶链反应(PCR)、DNA探针杂交方法与序列分析检测致病性和非致病性小肠结肠炎耶尔森菌携带ystB基因的情况。结果98株非致病性小肠结肠炎耶尔森菌中52株携带ystB基因,占53.06%。全部48株致病性小肠结肠炎耶尔森菌均不携带该基因。结论ystB基因仅存在于部分生物1A型非致病性小肠结肠炎耶尔森菌,而不存在于致病性菌株中。

志贺毒素A/B(ShT-A/B)亚单位基因的克隆与序列分析

应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺茵(Shigella dysenteriae type Ⅰ)中,分别扩增出约895bp和225bp的成熟ShT-A,B基因片段,直接克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-ShTA_2和pGEM-ShTB_3。测序结果表明,插入的片段是ShT-A,ShT-B,且与GenBank中ShT-A,B核酸序列完全一致,从而为重组ShT-A,B的表达研究奠定了基础。

金黄色葡萄球菌L型产B型肠毒素及其基因的研究

目的 :探讨金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )L型肠毒素B的产生量及其基因存在情况。方法 :将金葡菌诱导成稳定L型后 ,用ELISA法检测葡萄球菌肠毒素B(SEB) ,用PCR法检测SEB基因。结果 :金葡菌L型SEB的产生量与原菌比差别无显著性 (P >0 .0 5 ) ,PCR发现 4 78bp的阳性条带。结论 :金葡菌变异为L型后SEB产生量不变 ,其基因也未丢失。

霍乱毒素B亚单位基因的克隆及其核苷酸序列分析

利用 PCR技术从含有霍乱毒素 B亚单位 ( CTB)基因的质粒 p UCT1中扩增出不包括信号肽的 3 0 9bp的 CTB全基因 ,并通过点突变技术消除了 CTB阅读框内的终止密码子 ( TAA→GAA) ,以便于在 CTB基因的下游融合其他的外源基因。用限制性内切酶 Bam H 和 Eco R 对 PCR产物进行双酶切 ,以 T4DNA连接酶将其定向连接于经同样酶切处理的质粒 p ET-2 8b( +)的多克隆位点上 ,构建成重组质粒 p ECTB,转化至BL2 1 ( DE3 )中。经 Bam H 和 Eco R 双酶切分析和 PCR扩增检测 ,证明重组质粒 p ECTB中含有 CTB基因。核苷酸序列分析表明 ,克隆的

PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因

目的:金黄色葡萄球菌B型肠毒素是污染食品引起食物中毒的主要原因之一,针对进出口食品卫生监测的需要,研究一种简便、快速、准确的实验方法。方法:利用聚合酶链反应技术(PCR)采用特异的模板探针引物进行杂交,最后通过电泳技术与阳性对照进行比对,来判断阴阳性结果。结果:本方法检出率高,每克样品中有有4个金黄色葡萄球菌即可检出, 24h即可报告结果。结论:PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因快速、准确,检测周期短,既可提高检出率,又可节省检测时间。

转基因烟草生产霍乱毒素B亚单位的纯化

提取转基因烟草叶片总蛋白 ,用经溴化氰活化的Sepharose 4B偶联有抗CTIgG色谱柱 ,得到了表达产物CTB蛋白质。经PAGE、Westernblot。

艰难梭菌毒素A/B、BD-PCR毒素基因及GDH检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值

目的探讨艰难梭菌毒素A/B及其相关毒素基因检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值。方法收集2015年1月至2015年10月我院ICU病房腹泻疑似艰难梭菌感染患者的粪便标本133例作为研究对象,分别采用艰难梭菌培养法、CDAB法、PCR毒素基因检测法及艰难梭菌毒素GDH检测法进行检测,以艰难梭菌培养法结果为金标准,计算各方法的诊断指标所包含有的特异度、敏感度、阴性预测值和阳性预测值等。结果本研究收集的133例粪便标本中,经过金标准粪便样本厌氧培养法检出阳性结果 20例,阴性结果 113例。CDAB法具有低敏感度(0.550)和高特异度(0.912),诊断符合率为0.932,BD-PCR毒素基因检测法具有高敏感度(0.950)和高特异度(0.929),诊断符合率为0.932,艰难梭菌毒素GDH检测法的高敏感度(0.900)和低特异度(0.779),诊断符合率为0.797。结论对于疑似艰难梭菌感染,可联合艰难梭菌GDH、艰难梭菌毒素A/B(CDAB)或进行荧光定量PCR毒素基因共同检测,有效降低检测时间,为临床医师及时提供准确的诊断依据,并制定行之有效的治疗措施。

变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因在转基因番茄中的表达

目的:在获得含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄原代种子的基础上,应用分子生物学技术检测外源基因在转基因植株中的表达,测定目的蛋白的含量。方法:PCR筛选含编码变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄植株;提取番茄果实总蛋白,用BCA试剂盒测定番茄果实总蛋白含量;通过Western印迹检测外源蛋白的表达情况,并用ELISA法对外源目的蛋白含量进行测定。结果:PCR扩增分析可见1.6 kb特异性扩增条带,出现特异性条带的植株占总检测植株的55.6%;转基因番茄总蛋白含量为3.93 mg/mL,Western印迹结果显示,在PVDF膜上,约60 kD处出现特异性条带;ELISA测得表达的目的蛋白占番茄可溶性总蛋白的0.18%。结论:含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白。

IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达

目的 :IL - 2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达。方法 :分别在金黄色葡萄球菌肠毒素A2 2 7Ala、B基因的两端克隆上两个酶切位点HindⅢ ,KpnⅠ。将IL - 2基因突变 ,设计一段linker使之分别与SEA2 2 7Ala和SEB相连并克隆到PET表达载体中 ,在大肠杆菌DH5α(DE3) -Pass中表达。结果 :表达的蛋白占总蛋白 15 %。结论 :IL -

乙肝病毒/黄曲霉毒素双暴露因素下肝癌13号染色体畸变以及RB1基因表达的初步研究

目的探讨乙肝病毒/黄曲霉毒素双暴露下肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)13号染色体遗传学改变的特点,以及对定位于13q14.2基因座位点抑癌基因RB1的影响。方法 32例手术切除且经病理证实为HCC的癌组织,按照乙肝病毒与黄曲霉毒素的暴露情况,分为4个亚组:A组HBV(+)/AFB1(+)10例;B组HBV(+)/AFB1(-)10例;C组HBV(-)/AFB1(+)6例;D组HBV(-)/AFB1(-)6例。应用微阵列比较基因组杂交技术(ArrayCGH)检测包括13号染色体在内的23对染色体区段的变化情况,并通过RT-PCR检测RB1mRNA的表达情况。结果 32例中有15例染色体13q14.2发生缺失,缺失率为46.9%(15/32)。13q14.2缺失的发生频率在A组、B组、C组、D组中分别为80.0%(8/10)、50.0%(5/10)、33.3%(2/6)和0%(0/6)。其中A组分别与C组、D组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);B组与D组比较,差异亦有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测显示RB1mRNA的表达半定量灰度值在13q14.2缺失组中显著低于13q14.2无缺失组(P=0.003)。结论染色体13q畸变在HCC中是一个常见的分子生物学事件,其中13q14.2的缺失可能与HBV和AFB1双暴露的协同作用有关,HCC中13q14.2的缺失是导致RB1基因失活的因素之一。

乙肝病毒/黄曲霉毒素B_1双暴露相关性肝细胞癌的p53基因249位点突变与p53蛋白表达的关系

目的研究乙肝病毒/黄曲霉毒素B1双暴露相关性肝细胞癌的p53基因249位点突变与p53蛋白表达关系。方法通过IHG特殊免疫组织化学法检测55例手术切除经病理证实为原发性肝癌的HCC组织及10例正常肝组织中AFB1-DNA加合物的暴露情况,并根据是否同时存在HBV暴露加以分组,通过免疫组化S-P法检测并比较各组间p53蛋白的表达情况。同时,通过PCR结合直接测序的方法检测其p53基因第7外显子249密码子的突变情况。结果 p53基因第7外显子249位点的突变在实验组A与对照组C中均具有较高阳性突变率,其突变率分别为68.75%(22/32)、63.64%(7/11),在对照组B中的突变率较低,为16.67%(2/12),在正常对照组中无1例出现有突变。其中实验组A与对照组B及正常对照组D的比较差异具有统计学意义(P<0.05),而与对照组C比较差异无统计学意义(P>0.05);p53蛋白在其基因249位点突变阳性组与阴性组中的表达阳性率分别为92.86%(26/28)、60.87%(16/27),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 HCC的发生过程中,AFB1暴露与p53第7外显子249位点的突变密切关系相关,当同时存在乙肝病毒暴露的协同作用的情况下突变率更高;p53基因的突变可能是造成HCC中p53蛋白高表达的重要因素之一。

利用简并引物检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因

通过设计简并引物建立一种PCR技术同步快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A和B基因的方法。根据金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因编码序列,设计一对特异性简并引物SEAB来扩增靶基因片段,长度分别为105bp和135bp,通过对金黄色葡萄球菌肠毒素A、B菌株和4株对照菌株进行PCR检测,评价该引物的特异性;对金黄色葡萄球菌肠毒素B的DNA系列10倍稀释,对其灵敏性进行PCR检测。结果显示,金黄色葡萄球菌肠毒素A和B菌株的DNA检测结果呈阳性,4株对照菌株的检测结果呈阴性,通过基因测序证实了PCR产物的特异性,SEB的DNA最低检测浓度为3.58ng,整个检测过程不超过20h。建立了一个特异、快速灵敏的在同一条件下,金黄色葡萄球菌肠毒素A、B基因的PCR检测方法。