成熟志贺毒素A亚单位(ShT-A)全长与截短片段在E.coli中的表达及多抗制备

根据G enB ank中Ⅰ型痢疾志贺菌ShT-A基因的核苷酸序列,设计合成了2对引物,分别进行PCR扩增,将PCR产物分别与pGEM-T连接构建了克隆质粒pGEM-TA1和pGEM-TA2。用B amHⅠ和K pnⅠ以及B amHⅠ和X hoⅠ双酶切pGEM-TA1和pGEM-TA2,均得到大小为895 bp的ShT-A基因片段,分别与pQE 30和pET 21a(+)原核重组表达载体连接,构建pQE 30-A2和pET-21A1原核重组表达质粒。工程菌M 15/pQE 30-A 2和BL-21/pET-21A 1经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,均没有目的蛋白表达。这表明全长ShT-A可能对E.coli细胞产生毒性作用。DNA s is软件分析ShT-A基因序列,发现在513 bp处有H indⅢ位点,以ShT-A上游引物的B amHⅠ和H indⅢ从pGEM-TA1切出1个513 bp的截短片段,重新插入表达载体pQE 30,经PCR和双酶切鉴定正确后,得到pQE 30-A513重组表达质粒,转化E.coliM 15经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 000处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513相对分子质量相符。经薄层扫描分析,该截短片段的表达量约占菌体总蛋白的37.4%,主要为包涵体形式。免疫印迹结果表明,表达的重组ShT-A513蛋白同抗ShT-A513鼠多抗有特异性结合。

肠出血性大肠杆菌Ⅱ型志贺毒素A亚单位单克隆抗体S1D8的制备和初步应用

目的:制备肠出血性大肠杆菌(EHEC)Ⅱ型志贺毒素(StxⅡ)A亚单位单克隆抗体,探讨用特异性抗体检测EHEC志贺毒素的可行性。方法:通过基因工程操作制备了EHEC StxⅡA亚单位蛋白-StxⅡA,StxⅡA免疫小鼠制备鼠源单克隆抗体;对获得的抗体S1D8克隆的特异性用Western blot验证;最后用单抗S1D8制备亲和层析柱纯化StxⅡ,用志贺毒素检测试剂盒验证其特异性。结果:成功表达、纯化StxⅡA-GST融合蛋白;从融和的杂交瘤中筛选出一株特异性抗体克隆并命名为S1D8,S1D8在Western blot中可以与StxⅡ的A亚单位特异性结合,用S1D8亲和层析柱从EHEC的培养上清液中纯化了StxⅡ,在胶体金检测试验中StxⅡ阳性。结论:单克隆抗体S1D8的制备为基于毒素分子作为靶分子的EHEC免疫诊断、治疗研究奠定了基础。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位Stx2A的表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(Enterohem orrhagic Escherichia col,i EHEC)O157∶H7志贺样毒素A亚单位(Sh iga-like toxin,Stx2A),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Stx2A的编码基因stx2 a,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-11 c(+)-stx2 a,经测序鉴定后转化E.coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDS-PAGE和W esten b lot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2 a基因约950bp;原核表达质粒pET-11 c(+)-stx2 a经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli.BL21(DE3)中得到高效表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约31×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达92.3%。结论EHEC O157∶H7 Stx2A的高效表达与初步纯化,为探讨O157∶H7菌的感染机制奠定基础。

环介导等温扩增法快速检测霍乱肠毒素A亚单位基因

霍乱是由霍乱弧菌引起的、以腹泻为主要症状的烈性传染病。以发病急、传播快、涉及范围广、能引起大流行为特征，属甲类传染病，曾引起多次世界大流行。霍乱弧菌广泛地存在于水体和海产品中，浙江地处沿海，人们大多喜食海产品，因此霍乱仍是沿海地区最主要的传染病。霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）是霍乱弧菌毒力的决定因素。

成熟志贺毒素全长与截短A亚单位在E.coli中的表达及纯化

应用PCR技术从Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriaetype I)中,扩增出约895 bp的成熟ShT-A基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经蓝白斑筛选、PCR和双酶切鉴定正确后,命名为pGEM-TA2。测序结果表明,ShT-A与GenBank中ShT-A序列完全一致。用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒,得到为895 bp成熟ShT-A与pQE30原核重组表达载体连接,构建原核重组表达质粒。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,没有目的蛋白表达。DNAsis软件分析ShT-A基因序列,发现513 bp处有HindⅢ位点,故以ShT-A上游引物的BamHⅠ和HindⅢ从pGEM-TA2切出一个513 bp的截短片段,重新插入pQE30表达载体,得到pQE30-A513重组表达质粒,转化E.coliM15,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳观察,在20 ku处出现1条特异性的表达蛋白带,与截短ShT-A513分子量相符,表达量约占菌体总蛋白的37.4%,表达形式为包涵体。为抗体的制备提供了必要的物质基础。

志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位及酶活性部位的基因缺失、突变株表达产物免疫生物学特性

重组志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位pGEX＿Ansp及其酶活性部位的基因缺失株pGEX＿Ade及突变株pGEX＿Amu转化的大肠杆菌经诱导后,表达产物经超声波裂解并滤过除菌。ICR小鼠腹腔注射三种重组质粒转化菌诱导后菌体裂解物的除菌滤液,以检验重组表达产物的毒性和免疫原性;在Vero细胞上检测重组菌表达产物对Vero细胞的半数致死量(CD50)及免疫鼠血清对SLT＿Ⅱe毒素的中和实验三方面来比较pGEX＿Ansp、pGEX＿Ade和pGEX＿Amu的生物学特性,结果表明这三种基因工程菌表达产物经腹腔注射后可以诱导机体产生一定程度的保护性抗体。在Vero细胞上,pGEX＿Ansp的表达产物可在一定程度上使Vero细胞产生细胞病变,pGEX＿Amu的表达产物可在一定程度上抑制Vero细胞单层形成时间,而pGEX＿Ade对Vero细胞的生长无影响。