艰难梭菌毒素B基因克隆和分子生物学特性研究进展

艰难梭菌毒素B是一种细胞毒素,可以引起肠黏膜损害,以往认为毒素B的毒性比毒素A大,但必须通过毒素A才能致病。但近些年来,一些地区爆发了毒素A阴性毒素B阳性的病例,引起了人们对毒素B研究的重视,本文将对重点阐述毒素B基因功能片段克隆及其分子生物学特性的研究概况。

酶联荧光免疫分析技术检测粪便中艰难梭菌毒素A/B

目的应用酶联荧光免疫分析(ELFIA)技术及PCR联合检测粪便标本中艰难梭菌毒素A/B(CDAB),分析不同临床表现的住院患者粪便标本中CDAB的检出情况。方法收集北京大学第一医院2010年8月～11月242位住院患者粪便标本,用ELFIA法检测CDAB,对检测结果为可疑的标本用PCR复测。将患者分为非抗生素相关腹泻组和抗生素相关腹泻组,对两组的CDAB阳性率进行χ2检验,并分析检测结果与临床表现的相关性。结果 242位患者中,22例ELFIA法CDAB检测为阳性,12例检测结果为可疑。12例可疑标本有10例进行了PCR复测,8例(80.0%)CDAB基因阳性。两法联合检测共计30例为CDAB阳性,阳性率为12.4%。抗生素相关腹泻组CDAB阳性率(24.0%)显著高于非抗生素相关腹泻组(6.9%)(χ2=14.21,P<0.01)。CDAB阳性组的年龄(68.2±23.6)岁高于CDAB阴性组(58.7±23.9)岁(P<0.05)。结论 ELFIA法检测CDAB,有商品试剂盒,方法简便可靠。可疑阳性标本用PCR法检测tcdA/tcdB基因,可进一步提高阳性率。艰难梭菌毒素在抗生素相关腹泻患者检出率较高,与临床表现具有较好的相关性。

艰难梭菌毒素A/B、BD-PCR毒素基因及GDH检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值

目的探讨艰难梭菌毒素A/B及其相关毒素基因检测对艰难梭菌相关性腹泻的诊断价值。方法收集2015年1月至2015年10月我院ICU病房腹泻疑似艰难梭菌感染患者的粪便标本133例作为研究对象,分别采用艰难梭菌培养法、CDAB法、PCR毒素基因检测法及艰难梭菌毒素GDH检测法进行检测,以艰难梭菌培养法结果为金标准,计算各方法的诊断指标所包含有的特异度、敏感度、阴性预测值和阳性预测值等。结果本研究收集的133例粪便标本中,经过金标准粪便样本厌氧培养法检出阳性结果 20例,阴性结果 113例。CDAB法具有低敏感度(0.550)和高特异度(0.912),诊断符合率为0.932,BD-PCR毒素基因检测法具有高敏感度(0.950)和高特异度(0.929),诊断符合率为0.932,艰难梭菌毒素GDH检测法的高敏感度(0.900)和低特异度(0.779),诊断符合率为0.797。结论对于疑似艰难梭菌感染,可联合艰难梭菌GDH、艰难梭菌毒素A/B(CDAB)或进行荧光定量PCR毒素基因共同检测,有效降低检测时间,为临床医师及时提供准确的诊断依据,并制定行之有效的治疗措施。

艰难梭菌毒素B羧基端的表达与卵黄抗体制备

目的:在大肠杆菌中可溶性表达艰难梭菌毒素B羧基端(TcdB-c),免疫产蛋鸡,获得针对TcdB-c的卵黄抗体(IgY)。方法:人工合成TcdB-c的基因,将其克隆至pET32b(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达产物经金属螯合层析纯化,凝血酶酶切后得到目的蛋白TcdB-c;利用兔红细胞凝集和兔肠袢实验检测目的蛋白活性,用TcdB-c免疫产蛋鸡制备鸡卵黄抗体,分离纯化卵黄抗体并经ELISA测定抗体效价,用兔肠袢实验检测抗体的中和活性。结果:构建了TcdB-c的重组表达载体,诱导表达的融合蛋白相对分子质量约为79 000,经凝血酶酶切后的相对分子质量约65 000;目的蛋白免疫产蛋鸡后获得效价为1∶20 000的抗TcdB-c卵黄抗体,且该抗体可以中和TcdB-c对兔小肠的毒性作用。结论:获得了具有生物学活性的TcdB-c,并制备了针对TcdB-c的鸡卵黄抗体,为利用基因工程方法防治艰难梭菌感染打下了基础。

艰难梭菌毒素B适配子的筛选和鉴定

目的筛选和鉴定艰难梭菌毒素B适配子(Apt)。方法体外合成80bp的单链DNA(ssDNA)随机文库,重组表达艰难梭菌毒素B蛋白,利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选艰难梭菌毒素B的核酸适配子。使用DNA MAN5.2.2.0软件和mfold软件筛选出的适配子序列进行同源性和二级结构的分析,并利用非竞争酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定其亲和常数。结果经过12轮筛选,文库中随机ssDNA与艰难梭菌毒素B的结合率从0.8%增加到39.6%,筛选出51条适配子,二级结构最稳定的是Apt-B20,其亲和常数为3.76×10^(-7)。结论利用SELEX技术成功筛选出高亲和力的Apt,为临床上艰难梭菌感染的实验室快速诊断提供一定的参考依据。

台山地区艰难梭菌毒素A/B检测在院外和院内感染的临床应用

目的探讨艰难梭菌毒素A/B检测在台山地区院外和院内感染中的应用。方法收集2013年5月~2014年10月528例刚入院腹泻患者的粪便标本作为院外感染可疑病例组（院外感染组）,年龄段在8~75岁,男249例,女279例;收集同时间段523例住院超一周以上并使用抗生素3天以上的患者的粪便标本作为院内感染的可疑病例组（院内感染组）,年龄段在7~74岁,男209例,女314例。分别进行艰难梭菌毒素A/B检测,并结合细菌培养结果、临床诊断和疗效进行综合统计学分析。结果院外感染艰难梭菌率4%,院内使用抗生素后感染率16%。艰难梭菌毒素A/B检测对院外感染的检出率为85%,对院内感染的检出率为90%。结论艰难梭菌毒素A/B检测对台山地区院外和院内感染检测快速准确,值得在临床上推广应用。

一种生成艰难梭菌B类毒素的新方法

艰难梭菌毒素是梭状芽胞杆菌细胞毒素家族的一员。该毒素以UDP-葡萄糖为底物,可催化RhoGTP酶糖基化。该毒素含有3个结构域:CDB^(1-54b)包含1～54b位氨基酸,是催化区;CDB2包含901～1750位氨基酸,是跨膜区;CDB3包含1751～2366位氨基酸,是受体结合区。本文用UDP-2′,3′-双乙醛灭活艰难梭菌毒素B的糖基转移酶活性,灭活作用呈现量效和时效关系。

艰难梭菌的检测及临床分析

目的：了解我院艰难梭菌的感染流行情况,为防控院感爆发提供理论依据.方法：收集2016～2017年期间住院腹泻患者的大便标本,用艰难梭菌鉴别培养基显色培养,通过筛查菌落形态、 镜检,最终依赖质谱鉴定.同时对大便标本使用酶联荧光免疫测定艰难梭菌毒素A/B.收集阳性患者的临床资料,分析艰难梭菌感染相关的危险因素.结果：收集的大便标本经厌氧培养及鉴定,艰难梭菌培养阳性率为16.5％,艰难梭菌毒素检出率为12.3％,差异无统计学意义.单因素分析发现头孢一代、 头孢三代、 抗生素联用是引起艰难梭菌感染的潜在危险因素.多因素分析发现头孢三代的使用是感染艰难梭菌的独立危险因素.结论：我院艰难梭菌存在一定流行情况,同时存在易感因素,应严密监测,积极预防及控制.

艰难梭菌B毒素的纯化及其生物学特性

目的纯化艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)B毒素,并鉴定其生物学特性。方法将艰难梭菌VPI10463株经透析培养,50%饱和硫酸铵盐析,酸沉淀,收集上清液浓缩后,先采用分子筛Sephacryl S-300层析,收集目标蛋白峰,再进行DEAE Sepharose FF和DEAE Sephadex A-25离子交换层析,并对纯化产物进行各项生物学特性鉴定。结果最终纯化的艰难梭菌B毒素蛋白浓度为1.25 mg/ml;Vero细胞毒性为8.0×109 CU/mg;经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈单一条带,相对分子质量约为220 000,纯度为99.9%;免疫双扩散试验显示单一沉淀线。结论成功纯化了艰难梭菌B毒素,获得的B毒素纯度和细胞毒性较高,免疫反应性良好,为艰难梭菌毒素及其相关疾病的研究和防治奠定了基础。

腹泻患者艰难梭菌及其毒素A/B检出率分析

目的了解住院腹泻患者艰难梭菌及其毒素A/B的检出情况,为临床诊断抗生素相关性腹泻提供参考依据。方法收集2015年9月至2016年8月崇州市人民医院疑似抗生素相关性腹泻住院患者的粪便标本163份,用艰难梭菌快速检测试剂盒检测艰难梭菌特异性抗原谷氨酸脱氢酶(GDH);用酶联免疫荧光法检测GDH阳性标本中艰难梭菌毒素A/B的产生情况。结果 163份粪便标本中GDH阳性为34份,阳性率为20.86%。34份GDH阳性标本中艰难梭菌毒素A/B阳性率为41.18%(14/34),可疑阳性率为17.65%(6/34),阴性率为41.18%(14/34)。结论疑似抗生素相关性腹泻住院患者艰难梭菌GDH检出率较高,毒素A/B阳性率也比较高,提示临床应重视抗生素相关性腹泻患者艰难梭菌感染的诊断。

基于不同黏膜佐剂的艰难梭菌类毒素B疫苗微针经皮免疫效应研究

目的探索基于不同黏膜佐剂的艰难梭菌类毒素B(Clostridium difficile toxoid B,CdtB)疫苗的微针经皮免疫效果,为艰难梭菌感染的防治提供思路。方法纯化的艰难梭菌B毒素(TcdB)经甲醛脱毒制备成CdtB疫苗,采用不同剂量的疫苗单独或加入黏膜佐剂的方法,于0 d、7 d、14 d、28 d、42 d微针经皮免疫雌性BALB/c小鼠,定期检测小鼠特异性血清IgG和粪便中IgA的效价水平变化,通过细胞中和试验和艰难梭菌人工感染免疫小鼠的方法来评价疫苗的免疫保护效果。结果(1)CdtB疫苗单独微针免疫小鼠后,随着剂量与免疫次数的增加,产生了较好的血清特异性抗体IgG,粪便中也出现较高水平的IgA;(2)用含有热不稳定肠毒素(LT)佐剂、霍乱毒素B亚单位(CTB)佐剂的CdtB微针免疫小鼠,各组的血清特异性IgG效价趋势随着免疫剂量增加而提高,含有LT佐剂的免疫组效价变化趋势明显较好;与不加佐剂组比较,各组粪便中特异性IgA效价抗体水平变化趋势差异有统计学意义,但佐剂效应不明显;(3)分别用10μg CdtB单独微针免疫小鼠和腹腔注射小鼠,虽然微针免疫与腹腔注射后小鼠血清IgG效价差别不大,但微针免疫可明显提高粪便中特异性IgA水平;(4)细胞中和试验和小鼠攻毒保护试验结果说明CdtB疫苗微针免疫可产生一定的保护效力。结论CdtB疫苗微针经皮免疫小鼠的黏膜免疫效果较好,黏膜佐剂LT和CTB对CdtB疫苗的微针经皮免疫的佐剂效应不显著。

人艰难梭菌毒素B抗原表位抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

目的制备人艰难梭菌TcdB抗原表位抗体,建立针对人艰难梭菌TcdB双抗体夹心ELISA检测方法。方法通过生物信息学等方法预测人艰难梭菌TcdB蛋白的抗原表位,固相多肽合成法合成抗原并制备抗体Anti-TcdB1和Anti-TcdB2,ELISA检测效价并验证其特异性。用辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)标记TcdB2抗体,建立ELISA双抗体夹心法。利用棋盘滴定法筛选一抗最佳包被浓度、最佳样品稀释倍数及最适二抗工作浓度等条件,优化ELISA检测方法并确定临界值,用已知阳性、阴性标本及重组B蛋白验证该方法的特异性、灵敏度和重复性。结果间接ELISA确定Anti-TcdB1的效价为1∶512000,抗TcdB2抗体为1∶2048000。棋盘滴定等方法确定ELISA一抗最佳包被浓度0.5μg/ml,样品最佳稀释倍数1∶2,酶标抗体最佳稀释度为1∶20000。该诊断方法特异,不与其它肠道细菌感染出现交叉反应;重组B蛋白最低检测限为32.25ng/ml;试验的重复性良好,批内和批间变异系数均小于10%。结论本研究建立的检测人艰难梭菌TcdB的ELISA双抗体夹心法敏感、特异,重复性良好,可用于鉴别产毒素B艰难梭菌。

艰难梭菌毒素B诱导结肠癌细胞凋亡及相关机制研究

目的检测艰难梭菌毒素B(TcdB)对结肠癌SW480细胞增殖与凋亡的影响,研究其引起细胞凋亡的相关机制。方法采用不同浓度的TcdB处理SW480细胞,采用MTT法检测细胞增殖情况;用流式细胞术检测细胞的凋亡及线粒体膜电位变化情况。结果TcdB显著抑制了结肠癌SW480细胞的增殖,作用48 h后的抑制率为46.36%,呈一定的时间-浓度相关性;流式细胞仪检测结果表明,浓度为800 ng/ml的TcdB作用48 h,SW480细胞凋亡率为20.83%,呈一定的时间-浓度相关性。结论艰难梭菌毒素B能够抑制结肠癌SW480细胞增殖、诱导细胞凋亡,其机制可能与启动线粒体凋亡途径有关。

艰难梭菌培养联合酶法检测毒素蛋白(A/B)的临床应用价值探索

目的通过对艰难梭菌培养及毒素检测方法比较,建立艰难梭菌培养联合酶法检测毒素蛋白(A/B)的检测流程,评估其临床应用。方法收集 2015 年-2017 年住院腹泻患者粪便标本 852份,采用显色培养法( ChromID^TM)培养艰难梭菌,阳性菌株用酶联免疫荧光法检测其毒素蛋白A/B( Clostridium difficile toxins A and B,CDAB);用酶联免疫荧光法检测毒素蛋白A/B及阳性菌株,用PCR方法检测其tcdA和(或)tedB基因进行比较,运用检出率、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值进行效能评价。结果852 例粪便标本经显色培养共分离菌108株,粪便直接酶法A/B毒素蛋白检出率为5.99%(51/852);阳性菌株联合酶法检测A/B毒素蛋白检出率为10. 92%(93/852);108株阳性菌株联合PCR方法93株表达tcdA^+tcdB^+;6株表达tcdA^-tcdB^+;9株未表达,为tedA^-tcdB^-;阳性菌株用酶法检测毒素蛋白A/B结果93株阳性,15株阴性,且93株阳性经PCR检测基因均表达tedA^+tcdB^+;以PCR检测艰难梭菌毒素基因作为参考方法,培养阳性菌株联合酶法、粪便直接酶法检测毒素蛋白A/B的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为93. 94%、100%、100%.60%和51.52%、100%、100%、15. 79%;致性检验Kappa值分别为0.721和0. 150。结论显色培养后阳性菌株联合酶法检测艰难梭菌毒素蛋白A/B可以提高艰难梭菌检出率,与PCR毒素基因检测有较好一致性,操作简单,具有较好的临床应用价值。

兴化地区住院腹泻患者艰难梭菌感染的流行病学研究

目的了解兴化地区艰难梭菌的感染情况,为预防艰难梭菌感染的暴发流行提供参考依据。方法收集2018年5月至2021年4月兴化市某医院住院腹泻患者(年龄≥18岁)的粪便标本229例,进行艰难梭菌毒素基因检测(Xpert实时荧光PCR法,赛沛公司)、艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原(glutamate dehydrogenase antigen,GDH)和毒素检测(酶联免疫层析法,美艾利尔公司)。结果229例腹泻患者粪便标本,Xpert法检出艰难梭菌阳性19例(tcdB阳性,未检测到cdtA和tcdC缺失)、酶联免疫层析法检出艰难梭菌阳性19例(GDH阳性15例、毒素阳性3例、2者同时阳性1例),诊断为艰难梭菌感染19例(感染率8.30%)。结论兴化地区住院腹泻患者存在艰难梭菌感染病例,应做好相关预防控制工作。