基于纳米抗体-荧光素酶的黄曲霉毒素B1检测方法构建

黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种剧毒、致癌的食源性污染物,严重威胁食品安全和公共健康。为开发快速检测AFB1的生物发光酶联免疫分析(BLEIA)方法,系统测试了3种抗AFB1特异性纳米抗体(NB)与纳米荧光素酶(Nluc)融合蛋白(G8-Nluc、Nluc-NB26和Nluc-NB28)的可溶性表达、纯化情况及酶催化活性。基于3种融合蛋白分别建立BLEIA检测体系,选择Nluc-NB26用于谷物样品的分析和验证。结果表明,Nluc-NB26的可溶性表达量最高,稳定性更好,Nluc-NB28的可溶性表达量次之,而G8-Nluc基本不可溶。不同表面活性剂对G8-Nluc的促溶解性研究表明,添加N-月桂酰肌氨酸钠可显著提高其溶解度,纯化得到的3种融合蛋白均具有良好的酶活性及抗原结合活性。基于融合蛋白的BLEIA检测结果显示,Nluc-NB28-BLEIA、G8-Nluc-BLEIA和Nluc-NB26-BLEIA体系检测AFB1的IC_(50)值分别为4.213,1.697,2.169 ng/mL,表明G8-Nluc-BLEIA体系的灵敏度最高,Nluc-NB26-BLEIA与前者接近,Nluc-NB28-BLEIA最低。综合考虑融合蛋白的可溶性表达量、稳定性及检测性能,对Nluc-NB26-BLEIA开展实际样品的分析和验证,结果表明:这一方法检测谷物中AFB1的平均回收率在91.1%~104.1%之间,与商业化酶联免疫吸附测定试剂盒结果相似,而检测的时间和试剂成本明显降低。研究结果为开发快速、高灵敏的AFB1检测技术提供参考。

基于氧化应激和线粒体功能障碍的伏马毒素B1诱导线虫神经毒性机制

为研究线粒体功能和氧化应激在伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)诱导神经毒性中的作用,以秀丽隐杆线虫为模型,对FB1处理后的线虫行为表型以及包括氧化应激和线粒体功能相关指标变化进行分析。结果表明,20~200μg/mL的FB1暴露24 h以剂量依赖方式诱导细胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)相关基因(cyp35A2、sod-1、sod-3、ctl-2和ctl-3)的异常表达。此外,100~200μg/mL的FB1处理降低了线虫线粒体密度,并显著降低了三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平和线粒体膜电位(P<0.05)。200μg/mL的FB1处理显著抑制了线虫线粒体呼吸链复合物I和Ⅴ的表达,提高了线粒体分裂基因drp-1的表达水平。相关性分析显示,氧化应激和线粒体功能相关指标的表达与线虫行为学表型具有显著相关性。综上,FB1可能通过参与线虫氧化应激、线粒体呼吸链和线粒体动力学过程诱导神经毒性。

黄曲霉毒素B1诱导大鼠肝细胞凋亡率剂量效应模型的构建

通过黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)诱导大鼠肝细胞凋亡的定量数据,从而构建AFB1诱导大鼠肝细胞凋亡率的剂量效应模型。通过拟合模型获取决定系数和进一步的数学检验表明,Gamma模型(R2=0.996 4,赤池信息量准则=37.40,贝叶斯信息准则=17.19)优于其他模型。建议选用Gamma模型作为大鼠急性暴露于AFB1后肝细胞凋亡率的最优剂量效应模型,用于AFB1风险评估框架中的危害特征描述。

改性活性炭构建菌载体及其吸附玉米中黄曲霉毒素B1的工艺研究

旨在为生物处理黄曲霉毒素污染的粮食饲料提供技术支持,以活性炭(SH)为原料进行改性制备磁性活性炭(CSH),选用能高效降解黄曲霉毒素B1(AFB1)的芽孢杆菌属菌株WTX1与CSH载体共培养构建磁性菌载体(FCSH),脱除受污染玉米中的AFB1,对CSH进行BET比表面积、氮吸附-脱附等温线及其对AFB1的等温吸附曲线分析,考察FCSH构建条件和FCSH吸附条件对AFB1脱除效果的影响,并利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和扫描电镜对吸附AFB1前后的FCSH进行表征。结果表明:CSH为大孔结构,其对AFB1的等温吸附符合Freundlich方程;在固定化时间16 h、固定化转速和吸附转速160 r/min、固定化温度和吸附温度35℃、吸附pH 8、振荡时间48 h条件下,FCSH对AFB1脱除率为97.45%;通过FTIR及扫描电镜证实了FCSH对AFB1的吸附作用,且FCSH对AFB1的吸附效果强于CSH。综上,所制备的FCSH能高效脱除玉米中的AFB1。

介质阻挡等离子体降解乙腈溶液黄曲霉毒素B1规律解析

目的:花生、玉米及坚果的黄曲霉毒素B1污染是影响食品质量安全的关键因素,通过等离子体降解黄曲霉毒素B1来降低污染,并探究降解机理是当前的急迫需求。方法:利用等离子体处理技术,在放电功率200 W,放电时间5 s,放电间距0.4 cm条件下降解乙腈溶液中的黄曲霉毒素B1,采用高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪和高分辨质谱进行分析,以期获得介质阻挡等离子体法降解黄曲霉毒素B1的产物和路径。结果:分析出5种降解产物的分子式及结构式,其降解途径为Criegee机理、苯环甲氧基反应和亲核反应机理。在降解率为35.8%的情况下,根据5种降解产物毒性位点损失的情况,证明介质阻挡等离子体处理之后毒性与降解率一致。结论:本研究为利用介质阻挡等离子体降解花生、玉米和坚果制品中的黄曲霉毒素B1提供理论参考,后续试验可探讨不同降解率下的产物及反应过程,可通过动物实验或细胞实验进一步探索介质阻挡等离子体降解黄曲霉毒素B1后的潜在毒性验证。

猪β-防御素-2在黄曲霉毒素B1致小鼠肠道炎症损伤中的作用

旨在探究猪β-防御素-2(pBD-2)在黄曲霉毒素B1(AFB1)致鼠肠道损伤中的作用。本试验以4周龄KM小鼠为研究对象,将体重相近的30只健康小鼠随机均分为5组,分别为空白对照组(不做任何处理)、DMSO组(1%DMSO灌胃)、AFB1组(0.3 mg/kg AFB1灌胃)、pBD-2组(0.03 mg/kg pBD-2灌胃)和AFB1+pBD-2组(0.3 mg/kg AFB1灌胃28 d后再用0.03 mg/kg pBD-2灌胃28 d),试验持续56 d,通过观察小鼠肠道结构的变化以及采用qPCR和免疫荧光的方法检测炎症相关因子的表达水平。结果:与对照组相比,AFB1组小鼠的平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)均呈现显著下降趋势(P<0.05),料重比(F/G)降低,但差异不显著(P>0.05),而小鼠饲喂pBD-2以后ADG和ADFI均较AFB1组显著增加(P<0.05);HE染色结果显示,AFB1导致小鼠空肠黏膜显著损伤,并伴有严重的肠壁变薄,肠绒毛萎缩、稀疏,肠绒毛高度与隐窝深度之比、相对肠绒毛数量及肠壁厚度均显著降低(P<0.05),而使用pBD-2处理小鼠损伤模型,肠道结构可见显著恢复(P<0.05);qPCR和免疫荧光染色结果表明,AFB1处理小鼠可显著上调白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),但对白细胞介素-8(IL-8)的表达水平出现了下调趋势,而用pBD-2处理小鼠损伤模型后可显著下调炎症因子的表达水平,说明pBD-2对AFB1造成的肠黏膜炎症具有缓解作用。本研究结果为AFB1中毒的防控及pBD-2在畜牧生产中的应用提供了科学依据。

射频联合热风加热对玉米籽粒中黄曲霉毒素B1降解及玉米品质的影响

为研究射频-热风联合处理玉米中的黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)降解效果,分析不同初始水分质量分数(19.05%、22.25%、25.55%)、射频加热温度(55、65、75、85℃)和加热持续时间(10、15、20、25 min)对玉米籽粒中AFB1降解效果及玉米品质的影响。结果表明:射频-热风联合处理可有效降解AFB1,在高水分含量下,加热温度和时间一定,初始水分含量越高,AFB1残留量越高;初始水分含量一定,随温度增加和时间延长,AFB1残留量随之减少,且加热持续时间对降解效果的影响大于加热温度;射频-热风联合处理玉米籽粒过程中,对其品质有一定影响,随温度升高和时间延长,与对照组相比,蛋白质、脂肪含量无显著差异(P>0.05),黏度系数显著降低(P<0.05);低场核磁共振分析表明,射频加热过程中水分迁移效果明显,且水分迁移特性与玉米的糊化特性、蛋白质、脂肪含量显著相关(P<0.05)。

量子点荧光微球免疫法定量检测小麦中黄曲霉毒素B1

目的建立量子点荧光微球免疫法快速检测小麦中黄曲霉毒素B1的方法。方法采用量子点荧光微球作为荧光标记物,与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体偶联,构建量子点荧光微球探针。优化缓冲液pH、抗体最小标记量、荧光探针用量和包被抗原浓度等实验条件,建立检测卡上T线和C线信号峰值面积的比值与样本中黄曲霉毒素B1浓度的关系,构建定量标准曲线。针对小麦样品,将该检测方法与时间分辨荧光定量检测方法进行比较。结果本研究建立的荧光定量免疫层析检测方法最佳反应条件为:pH 7.5磷酸钠缓冲液,抗体标记量为20μg,荧光探针用量为4.0μL,抗原质量浓度使用0.40mg/mL。小麦中黄曲霉毒素B1的定量检测线性范围为0.05~25.00μg/kg,相关系数(r^(2))为0.9994,检出限为0.02μg/kg,定量限为0.05μg/kg。加标回收率为91.50%~115.00%,变异系数为1.88%~5.46%。结论本研究建立的荧光定量免疫层析方法快速、准确、稳定性好、可靠性高,适用于小麦中黄曲霉毒素B1的现场快速检测。

基于全合成纳米抗体库的黄曲霉毒素B1抗体制备

目的利用全合成纳米抗体库筛选制备黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1,AFB1)的纳米抗体。方法制备AFB1完全抗原并依托全合成纳米抗体库进行4轮筛选,将捕获的高亲和力抗体基因转化至原核表达系统表达,分析纯化后的抗体特异性及亲和力,并构建抗体G5-AFB1复合三维结构,分析二者的结合特点。结果在AFB1完全抗原制备基础上筛选,随着轮数的增加,特异性噬菌体明显富集,最终获得一株阳性单克隆G5,经鉴定,其半数效应浓度(effec-tive concentration 50%,EC50)为0.953μmol/L,半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为43μmol/L。另外,G5-AFB1复合物不仅形成了稳定的氢键,也具备较好的疏水和静电作用。结论通过全合成纳米抗体库可以筛选出良好的AFB1抗体,为AFB1检测与治疗提供了良好基础,也证实了噬菌体展示技术以及全合成纳米抗体库在小分子生物毒素抗体制备中具有较大的发展潜力。

大曲中黄曲霉毒素B1的高效液相色谱检测方法

建立一种利用高效液相色谱检测酿酒大曲中黄曲霉毒素B1的方法。通过对前处理过程的溶剂选择、提取溶剂浓度、提取时间、免疫亲和柱前溶剂浓度的实验,采用单因素分析、正交实验设计找出最佳前处理条件,再通过线性范围、重复性、加标回收率对方法进行评价。此方法检测灵敏度高、重复性好,各类大曲的加标回收率都在85%~95%,结果可靠,适合各酿酒企业对大曲中黄曲霉毒素B1的内部风险控制。

复杂食品基质中黄曲霉毒素B1测定方法改进优化

改进GB 5009.22-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中高效液相色谱法测定复杂食品基质(花椒、胡椒和辣椒等)中的黄曲霉毒素B1的方法,将提取时甲醇–水溶液(70:30)用量提高至30 mL,上样液混匀后重复高速离心一次,上样液滴完后加入5 mL PBS缓冲液淋洗免疫亲和柱,色谱条件改为梯度洗脱,分别提高色谱柱温度和衍生反应管温度为44℃和80℃,该优化方法较好地减少了样品中黄曲霉毒素B1的损失,净化过程更简单、快速,能大幅减少高效液相色谱分析时间,回收率和精密度更满意,适用于花椒、胡椒和辣椒类样品中黄曲霉毒素B1的检测分析。

HPLC-柱后光化学衍生法测定玉米中黄曲霉毒素B1的不确定度评定

本文采用HPLC-柱后光化学衍生法测定玉米中黄曲霉毒素B1含量,通过系统分析整个测定过程的影响因素,评估不确定度来源,评定各个不确定度分量,发现标准物质浓度、标准溶液配制与测量重复性引入的不确定度对测量结果的影响较大。当玉米样品中黄曲霉毒素B1含量为7.86μg·kg^(-1)时,扩展不确定度为0.68μg·kg^(-1)(k=2)。

坚果类农产品样品状态与保存条件对黄曲霉毒素B1检测结果影响的研究

本研究通过培养坚果类阳性样品,在不同温度、不同颗粒状态、不同保存时间下进行取样检测,旨在评估样品保存温度、保存时间以及样品状态对黄曲霉毒素B1检测结果的影响。结果表明,阳性样品在30℃条件下,黄曲霉毒素B1含量明显增加,在0~4℃和-18℃保存条件下,阳性样品的检测浓度基本不变;样品颗粒状态对检测结果影响较大,粉碎后的样品中黄曲霉毒素B1的含量增加更明显。

花生及其制品中黄曲霉毒素B1的检测试验分析

为实现对花生及其制品中黄曲霉毒素B1进行定性和定量分析,本研究通过同位素内标法和低温高速离心净化法建立了一种高效液相色谱-质谱法的测定方法。该方法检出限为0.003μg/kg,定量限为0.010μg/kg,精密度和准确率良好;通过该方法对市面上的18种花生及其制品的商品进行抽检,合格率为100%;生物可给性分析结果表明,花生奶的生物可给性较高;胃肠消化阶段的黄曲霉毒素B1生物可给性显著高于胃消化阶段。

高通量酶联免疫吸附法测定黑参及其制品中黄曲霉毒素B1的含量

目的探究黑参及其制品中黄曲霉毒素B1的污染情况,填补该领域的研究数据空白,为其食品安全性评估提供数据支撑,探索可被广泛应用于此类产品中黄曲霉毒素B1的筛查方法。方法采用高通量酶联免疫吸附法测定黑参及其制品共120个样本中的黄曲霉毒素B1的含量,使用统计学方法对实验数据进行分析,同时进行方法学考察,验证该方法的灵敏性与精密度。结果该方法的准确度与精密度较好,定量限为0.5μg/kg,阳性检出率为46%,黑参、黑参粉、黑参液、黑参膏的黄曲霉毒素B1含量平均值分别为1.417、2.227、0.691、1.264μg/kg,不同类型样本间存在显著差异。结论整体情况良好,但存在一定的黄曲霉毒素B1污染风险,该方法适用于黑参及其制品中黄曲霉毒素B1的高通量筛查。

高效液相色谱法测定食用植物油中黄曲霉毒素B1的要点与步骤

由于生产、储存和加工过程中的各种因素,植物油中往往存在着一些有害物质,其中包括黄曲霉毒素B1(简称AFB1)。AFB1是一种致癌物质,长期摄入可能导致肝癌等严重疾病。基于此,本文简单讨论测定食用植物油中AFB1的意义,深入探讨高效液相色谱法测定食用植物油中AFB1的要点与步骤,以供参考。

HPLC法测定远志中黄曲霉毒素B1含量的不确定度评定

为评定高效液相色谱法测定远志中黄曲霉毒素B1含量的不确定度,依据国家计量技术规范JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》,对随机选取的6个远志样品,建立数学模型,从标准溶液稀释、样品称量、样品最终定容体积和仪器测定重复性等方面分析不确定度来源,量化不确定度分量,计算合成不确定度和扩展不确定度.实验结果表明远志中黄曲霉毒素B1测定结果合成标准不确定度为0.01639μg/kg,扩展不确定度0.03278μg/kg.不确定度评定结果表明:HPLC法对远志中黄曲霉毒素B1含量的测定数据可靠,远志中黄曲霉毒素B1含量的测量不确定度主要来源于重复性实验、标准曲线的拟合、液相色谱仪的使用.

饲料中黄曲霉毒素B1对克氏原螯虾幼虾生长、饲料利用和肝胰腺组织结构的影响

以含不同浓度黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))(0、10、100和1000μg/kg饲料)的4种饲料饲喂初始均重为(0.382±0.005)g的克氏原螯虾(Procambarus clarkii)幼虾42d,探讨AFB_(1)对克氏原螯虾幼虾生长性能、饲料效率和肝胰腺组织结构的影响。结果显示,100和1000μg/kg毒素组幼虾的存活率、摄食率、终末体重、特定生长率和饲料效率均显著低于对照组,10μg/kg毒素组与对照组无显著差异。10μg/kg毒素组幼虾肝胰腺碱性磷酸酶(AKP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽转移酶(GST)活性和丙二醛(MDA)含量均与对照组无显著差异,超氧化物歧化酶(SOD)活性显著低于对照组。饲料AFB_(1)含量≥100μg/kg时显著影响了克氏原螯虾幼虾上述肝胰腺酶的活性。10μg/kg毒素组肝胰腺组织结构发生轻微变化,100和1000μg/kg毒素组幼虾的肝胰腺表现出严重病变,R细胞数量减少而B细胞数量增多。超微结构结果显示,随着AFB_(1)浓度的增加,肝胰腺细胞内线粒体肿胀,粗面内质网扩张,囊泡增多,脂滴变大。饲料中AFB_(1)≤100μg/kg时克氏原螯虾幼虾体内均未检测出AFB_(1)。1000μg/kg毒素组幼虾虾体中AFB_(1)积累量为1.65μg/kg,未超过FDA食品安全限定标准。综上所述,饲料中AFB_(1)含量≥10μg/kg时即对克氏原螯虾幼虾产生不良影响,说明克氏原螯虾幼虾对AFB_(1)较为敏感。

黄曲霉毒素B1激活核转录因子-κB信号通路引起牛乳腺上皮细胞发生炎性反应

本试验旨在研究不同浓度黄曲霉毒素B1(AFB1)对牛乳腺上皮细胞(MAC-T细胞)中核转录因子-κB(NF-κB)信号通路介导的炎症反应的影响。向MAC-T细胞中分别加入不同浓度的AFB1处理培养液培养24 h,分析AFB1对MAC-T细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、促炎细胞因子含量和基因表达以及NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。结果显示:1)与对照组相比,2.5、5.0、10.0和20.0μmol/L AFB1处理MAC-T细胞均能显著或极显著降低细胞活力(P<0.05或P<0.01),显著或极显著升高培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性(P<0.05或P<0.01),且呈剂量依赖性。2)与对照组(0μmol/L AFB1)相比,5.0、10.0和20.0μmol/L AFB1处理MAC-T细胞使上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01);5.0μmol/L AFB1处理使MAC-T细胞中IL-1β、IL-8和TNF-αmRNA的相对表达量显著或极显著升高(P<0.05),10.0μmol/L AFB1处理使MAC-T细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的相对表达量显著或极显著升高(P<0.01),20.0μmol/L AFB1处理使MAC-T细胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的相对表达量极显著升高(P<0.01)。3)与对照组相比,10.0和20.0μmol/L AFB1处理使MAC-T细胞中磷酸化P65(p-P65)、磷酸化核转录因子-κB抑制因子α(p-IκBα)蛋白的相对表达量极显著升高(P<0.01)。上述结果提示,AFB1通过促进炎症相关因子表达和激活NF-κB信号通路,引起MAC-T细胞发生炎性反应。

姜黄素对黄曲霉毒素B1诱导的斑马鱼肝损伤的修复作用

通过构建黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)诱导的斑马鱼肝损伤模型,研究姜黄素对斑马鱼肝脏的修复作用。采用荧光显微镜观察斑马鱼仔鱼肝脏荧光及形态变化;苏木精-伊红染色观察斑马鱼仔鱼肝脏组织病理变化情况;油红O染液对斑马鱼仔鱼进行整体染色,观察卵黄囊处脂肪的吸收情况;行为分析仪进行运动行为分析;超高效液相色谱串联质谱仪测定其体内氨基酸含量的变化。结果显示,经姜黄素修复后,斑马鱼仔鱼肝脏处的荧光面积及荧光强度恢复至正常水平,且姜黄素显著改善了斑马鱼肝脏组织的病理形态,促进了卵黄囊对脂肪的吸收,减少了卵黄囊处脂质积累,恢复了仔鱼的运动行为。该研究表明,姜黄素通过调节与脂肪合成、抗氧化和能量代谢相关的通路,起到了修复肝损伤的作用。