岩栖蝮蛇毒腺cDNA文库构建、降纤酶基因克隆和序列分析

目的采用链转化法和长距离PCR技术,构建岩栖蝮蛇(Gloydiussaxatilis)毒腺cDNA文库,克隆、分析降纤酶基因。方法用Trizol试剂盒从岩栖蝮蛇毒腺提取总RNA,再用oligo(dT)-生物素-链菌素-磁珠法从总RNA中分离mRNA,反转录合成cDNA第一链,长距离PCR合成第二链cDNA。回收cDNA用限制性内切酶消化产生黏性末端,色谱去除小于500bp片段,纯化的cDNA插入载体pBluescript,电转化E.coliDH5α,得到岩栖蝮蛇毒腺cDNA文库;测定制备的降纤酶上游氨基酸序列,并推导其基因序列,合成引物。从该cDNA文库克隆降纤酶基因并分析基因结构。结果岩栖蝮蛇毒腺cDNA文库的库容为2.0×106,降纤酶基因开框读码序列全长777个核苷酸,编码258个氨基酸,活性中心His65、Asp110、Ser204和6对二硫键进化上高度保守。结论该文库符合建库标准库容要求,为筛选新的目的基因和进一步基因操作提供了有效平台;克隆的降纤酶基因与GeneBank中其它蛇毒丝氨酸蛋白酶氨基酸序列同源性在86%以上。