免疫印迹法检测抗胆碱能毒蕈碱受体3抗体及其在干燥综合征诊断中的意义

目的建立免疫印迹法(WB)检测抗毒蕈碱受体3(M3受体)抗体的方法,探讨该抗体对干燥综合征(SS)诊断的意义。方法建立WB测定抗M3受体抗体的方法,检测80例SS患者、80例其他风湿性疾病及40名正常对照者血清中的抗M3受体抗体,并分析该抗体与SS的临床及实验室指标的关系。结果抗M3受体抗体在80例SS患者中的阳性率为83.8%(67/80),而在系统性红斑狼疮(SLE)及正常人中分别为5.0%(2/40)和2.5%(1/40),类风湿关节炎(RA)中无1例阳性。抗M3受体抗体对SS的敏感性和特异性分别为83.8%和97.5%,阳性预测值为95.7%,阴性预测值为90.0%。抗M3受体抗体在抗SSA抗体、抗SSB抗体、琢-胞衬蛋白抗体阴性的SS患者血清中的阳性率分别为80.0%、82.5%及81.2%。该抗体在抗SSA抗体、抗SSB抗体及琢-胞衬蛋白抗体阳性的SS患者血清中的阳性率分别为87.5%、88.2%及85.4%。抗M3受体抗体阳性的SS患者与该抗体阴性的SS患者在口干、眼干、脏器受累的发生率,IgG、IgA、血沉(ESR)升高及抗核抗体(ANA)、类风湿因子(RF)阳性率方面无统计学意义。结论利用sf9细胞表达的重组M3受体蛋白可以检测SS患者血清中的抗M3受体抗体。该抗体是一种对SS诊断较为特异的标记性抗体之一。

毒蕈碱型胆碱能受体M3调控肝癌细胞侵袭转移的研究

目的探讨毒蕈碱型胆碱能受体M3(muscarinic cholinergic receptors 3,ChRM3)活化对人肝癌细胞侵袭、转移能力的影响及其分子机制。方法 Western blot检测两种人肝癌细胞株Hep G2和SMMC-7721中ChRM3受体的表达;采用氯贝胆碱(Beth)及达菲那新(UK88525)处理肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞,分为空白对照组、Beth组、Beth+UK88525组、UK88525组,经处理48 h后,Transwell实验检测两种肝癌细胞经不同分组处理后侵袭、迁移能力的变化,Western blot检测各组细胞中上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)标志蛋白的表达及下游信号通路PI3K/Akt的变化;采用shRNA干扰质粒经Lipofectamine 2000TM转染肝癌细胞Hep G2以沉默ChRM3,分为空白对照组、Beth组、Beth+sh ChRM3组、sh ChRM3组,分别检测细胞的侵袭、转移能力及EMT、下游PI3K/Akt的改变。结果 Hep G2和SMMC-7721两种肝癌细胞中均有ChRM3受体的表达;Transwell实验显示:Beth单独处理组对肝癌细胞的迁移和侵袭有明显的促进作用,而UK88525能够抑制Beth对肝癌细胞迁移侵袭能力的促进作用(P<0.05);Western blot结果显示:Beth单独处理组能够上调EMT标志蛋白N-Cadherin和Vimentin,下调E-Cadherin的表达,UK88525处理后能够明显抑制Beth促进Hep G2细胞EMT的过程(解除Beth对Hep G2细胞EMT的促进过程),同时也能够抑制PI3K/Akt的活化(P<0.05);干扰质粒沉默ChRM3受体同样能够抑制Beth促肝癌细胞迁移、侵袭的作用,并且抑制Beth诱导的EMT和下游PI3K/Akt的活化(P<0.05)。结论 ChRM3活化能够通过PI3K/Akt信号通路促进肝癌细胞的侵袭和转移。

毒蕈碱受体3抗原表位多肽诱导干燥综合征动物模型的研究

利用毒蕈碱受体3(M3R)抗原表位多肽N49免疫BALB/c小鼠,以生理盐水注射小鼠作为对照组,检测各组小鼠血清抗N49多肽抗体和颌下腺淋巴细胞浸润情况。结果显示,多肽免疫组小鼠血清抗N49多肽抗体阳性率达100%(13/13),抗体滴度普遍从免疫后第21天开始显著上升,其中有5只(5/13)小鼠出现颌下腺淋巴细胞浸润;对照组小鼠血清抗N49多肽抗体均为阴性,仅有1只(1/14)出现轻度颌下腺淋巴细胞浸润。进一步以M3R分子不同抗原表位多肽N251和N412为包被抗原,检测以上实验小鼠血清中的抗体情况,显示N49多肽免疫组小鼠血清中抗N251和N412多肽抗体阳性率分别为100%(13/13)和85%(11/13),且两者抗体滴度变化趋势与抗N49多肽抗体一致,而对照组小鼠血清中抗N251和N412多肽抗体均为阴性。表明N49多肽较成功地建立了BALB/c小鼠的干燥综合征(SS)模型,诱导出了典型的自身抗体、颌下腺淋巴细胞浸润和自身抗原M3R分子内表位扩展等特征,为进一步研究M3R等自身抗原在SS发生中的作用机制奠定了基础。

抗毒蕈碱受体3多肽抗体测定在干燥综合征诊断中的意义

目的建立酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测抗毒蕈碱3受体多肽（M3RP）抗体的方法，探讨该抗体在干燥综合征（SS）诊断中的意义。方法以固相合成的多肽M，RP为包被抗原，ELISA定量检测94例干燥综合征，160例其他结缔组织病及200名正常人血清中的抗M3RP抗体水平，并分析其与SS临床表现的相关性。结果抗M3RP抗体在原发干燥综合征（pSS）、继发干燥综合征（sSS）患者中阳性率分别为84．6％和81．3％，在其他结缔组织病和正常对照组中的阳性率分别为8．8％和1％。M3RP抗体在SS患者中阳性率显著高于其他结缔组织病患者及正常对照组（尸〈0．01）。而且，M3RP抗体在pSS和sSS中的特异性均为91．3％。pSS患者与sSS患者抗M3RP抗体阳性率差异无统计学意义。抗M3RP抗体与SS患者临床表现和脏器受累情况无明显相关性。该抗体在抗α-胞衬蛋白、抗SSA、抗SSB和抗核抗体阴性的S患者中抗M3RP抗体的阳性率分别为85％、89．3％、88．9％和95．2％。在pSS中，抗M3RP抗体阳性的患者血清中IgG水平明显高于抗体阴性的患者。结论①ELISA法可检测pSS和sSS患者血清中的抗M3RP抗体，该抗体为诊断SS的较为特异的自身抗体之一。②抗M3RP抗体对其他自身抗体阴性的SS诊断有参考意义。

原发性干燥综合征患者毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型3及其受体的变化及临床意义

目的了解毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型3(muscarinic acetylcholine receptor M3,CHRM3)及毒蕈碱型乙酰胆碱受体3亚型抗体(M3 muscarinic acetylcholine receptor antibody,CHRM3-Ab)在原发性干燥综合征(primary Sjgren’s syndrome,pSS)发病过程中的可能作用。方法川北医学院附属医院风湿科2010年4月至2011年12月门诊及住院pSS患者43例为pSS组,同期29名健康体检女性为正常对照组。收集两组临床资料及实验室指标。实时荧光定量聚合酶链式反应检测pSS患者及健康体检者外周血单个核细胞CHRM3转录水平,酶联免疫吸附试验检测血浆CHRM3-Ab浓度,进行CHRM3转录水平、CHRM3-Ab与临床指标的相关性分析。结果 pSS组CHRM3转录水平与CHRM3-Ab浓度显著高于正常对照组,差异均有统计学意义[(0.00014±0.00030)vs(0.00009±0.00004),P<0.05;(227.29±154.81)pmol/Lvs(141.44±71.04)pmol/L,P<0.01]。Spearman相关性分析发现,pSS患者CHRM3-Ab浓度与血细胞沉降率及IgG均呈负相关(r分别=-0.452、-0.470,均P<0.05)。结论 CHRM3转录水平和CHRM3-Ab在pSS患者的高表达可能在疾病发生发展中发挥重要作用;CHRM3-Ab可能通过与CHRM3非竞争性结合而抑制乙酰胆碱与其受体作用,导致腺体分泌减少。加强对CHRM3和CHRM3-Ab研究,有望为诊治pSS带来新契机。

毒蕈碱受体3抗原表位筛选及其在原发性干燥综合征诊断中的作用

运用计算机软件分析毒蕈碱受体3(M3R)蛋白的结构特点及抗原决定簇分布,根据结果设计合成3条多肽。比较合成多肽与抗M3受体抗体阳性干燥综合征(SS)患者血清IgG的反应强弱,获得一条抗原抗体反应最强的抗原表位多肽(N49)。进一步以多肽N49作为包被抗原,检测原发性SS(pSS)患者41例,继发SS(sSS)患者25例,系统性红斑狼疮(SLE)患者34例,类风湿关节炎(RA)患者80例和正常人174例血清中抗M3多肽IgG抗体,结果显示该多肽抗体在原发性SS患者血清中的阳性率为53.7%,明显高于sSS患者28%、SLE患者8.8%、RA患者25%和正常人12.1%(P<0.05)。抗N49多肽抗体在pSS诊断中的敏感性为53.7%,特异性为83.7%,而且该抗体的检测对于抗SSA抗体、抗SSB抗体或抗α-胞衬蛋白(-αfodrin)抗体阴性的pSS患者的诊断具有补充作用。表明,筛选获得的M3抗原表位多肽N49,其检测抗体在pSS临床血清诊断中具有很好的应用价值。

海马胆碱能神经刺激肽通过活化3型毒蕈碱受体促进INS-1细胞胰岛素释放

目的明确海马胆碱能神经刺激肽(HCNP)对INS-1细胞胰岛素分泌影响,并对其可能作用的毒蕈碱样胆碱能受体途径进行分析。方法 INS-1细胞随机分为3组:对照组、HCNP组、HCNP+佛波酯(PMA)组。对照组给予RPMI 1640液培养,HCNP组给予人工合成HCNP(50 pg/ml)与RPMI 1640液共培养,HCNP+PMA组予人工合成HCNP与RPMI 1640液共培养后,行胰岛素释放前18 h加入PMA(10 nmol/L);应用放射免疫方法检测各组不同浓度葡萄糖培养液中胰岛素含量。实时定量PCR检测对照组、HCNP组HCNP前体蛋白(HCNP-pp)、胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)、3型毒蕈碱样受体(3-typemuscarinic receptor,M3R)基因水平表达情况。结果浓度为3.3 mmol/L葡萄糖,三组间胰岛素含量无明显差异。浓度为5.6mmol/L、16.7 mmol/L葡萄糖作用下,HCNP组胰岛素含量均高于对照、HCNP+PMA组,差异具有统计学意义。HCNP组INS-1细胞HCNP-pp、ChAT、M3R三者mRNA含量均高于对照组,差异具有统计学意义。结论 HCNP通过提高ChAT活性,推测影响乙酰胆碱合成,进一步活化M3R,促进胰岛素分泌,PMA可阻断此作用。

毒蕈碱胆碱能受体3在小细胞肺癌增殖和迁移中的调节作用

目的:研究毒蕈碱胆碱能受体3(M3R)在人小细胞肺癌(SCLC)中的表达及其作用。方法:体外培养人SCLC细胞株SBC3和H82,RT-PCR和Western blotting法检测M3R的表达,MTT法和Boyden chamber法分别检测胆碱受体激动剂碘化乙酰胆碱(ACh)及M3R拮抗剂4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine methiodide(4-DAMP)对SBC3细胞增殖和迁移的影响。结果:SBC3和H82细胞均表达M3R,SBC3细胞M3R蛋白相对表达强度是H82细胞的2.65倍。ACh浓度依赖性地刺激SBC3细胞增殖,10-4和10-3mol/L ACh在48h和72h作用明显(P<0.01)。4-DAMP浓度依赖性地阻断ACh对细胞增殖的刺激作用,48h时,10-5mol/L4-DAMP阻断ACh的作用(P<0.05),至72h,10-7、10-6mol/L(P<0.05)和10-5mol/L(P<0.01)4-DAMP都能阻断ACh的作用。无外源性ACh的情况下,10-6、10-5mol/L4-DAMP在48h都能明显地抑制细胞增殖(P<0.01),在72h,10-5mol/L4-DAMP的作用(P<0.01)强于10-6mol/L4-DAMP(P<0.05)。ACh浓度依赖性地增强SBC3细胞向人纤维结合蛋白(Fn)的迁移,10-4mol/L ACh增加细胞迁移约3倍,10-6、10-5mol/L4-DAMP几乎完全阻断10-4mol/LACh刺激的SBC3细胞迁移(P<0.01)。结论:人SCLC细胞表达M3R,M3R拮抗剂抑制SCLC细胞增殖和迁移。

血清毒蕈碱乙酰胆碱受体m3自身抗体水平对甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断价值

背景肝细胞癌(HCC)是一种恶性程度较高的癌症。甲胎蛋白(AFP)是临床常用的HCC诊断标志物,但其灵敏度仅为41%~65%,漏诊率较高,因此亟须寻找新的诊断标志物和诊断方法以提升AFP阴性患者等的HCC检出率。目的评估毒蕈碱乙酰胆碱受体m3自身抗体(m3AchR-Ab)对AFP阴性HCC患者的诊断效能,并探索m3AchR-Ab对HCC患者的诊断价值。方法选取2011年11月至2015年9月入库于新疆医科大学第一附属医院标本库的257例患者血清样本,其中90例已确诊为HCC患者的血清样本为HCC组,89例已确诊为良性肝病(肝硬化及肝血管瘤等肝病)患者的血清样本为良性肝病组,78例健康受试者的血清样本为对照组。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测并比较3组血清m3AchR-Ab水平,分析血清m3AchR-Ab水平与HCC患者性别、年龄、HCC肿瘤大小(最大直径)和数量、TNM分期、淋巴结转移、远处转移、乙肝表面抗原(HBsAg)的关系,采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清m3AchR-Ab水平对AFP阴性HCC的诊断价值。结果HCC组血清m3AchR-Ab水平高于良性肝病组和对照组血清(P<0.05)。m3AchR-Ab水平与HCC肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和HBsAg相关(P<0.05)。血清m3AchR-Ab水平诊断AFP阴性HCC的ROC曲线下面积为0.69〔95%CI(0.54,0.83)〕,最佳截断值为74.00 ng/ml,灵敏度为64.00%,特异度为91.02%。血清m3AchR-Ab联合AFP水平诊断HCC的ROC曲线下面积为0.90〔95%CI(0.85,0.95)〕,灵敏度为90.00%,特异度为88.02%。结论血清m3AchR-Ab水平对AFP阴性HCC具有一定的诊断价值,且使用m3AchR-Ab和AFP联合诊断可提高HCC诊断效能,这可为未来研究新型HCC诊断标志物提供更多参考。

毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3在肝门部胆管癌中表达及临床意义

目的:探究毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3(CHRM3)在肝门部胆管癌中表达及其与预后的关系。方法:选取2013年1月至2017年4月本院收集的手术切除的69例肝门部胆管癌组织及69例胆管癌癌旁正常胆管组织为研究对象。采用免疫组化法测定肝门部胆管癌组织和癌旁组织中CHRM3表达情况,分析CHRM3表达水平与肝门部胆管癌临床病理特征的关系,术后随访3年探究CHRM3表达水平与肝门部胆管癌患者预后的关系。结果:CHRM3在癌旁组织和肝门部胆管癌组织阳性率分别为7.25%和84.06%,差异具有统计学意义(P<0.05)。肝门部胆管癌组织中CHRM3表达水平与年龄、性别无关(P>0.05),与病理分期、病理分级、淋巴结转移、神经浸润有关(P<0.05)。Kaplan-Meier法显示CHRM3阴性肝门部胆管癌患者平均生存时间为(33.69±0.76)个月,显著长于CHRM3阳性肝门部胆管癌患者(23.37±1.02)个月(P<0.05)。多因素分析表明,神经浸润、CHRM3阳性是肝门部胆管癌患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)。结论:CHRM3在肝门部胆管癌中阳性表达率显著上升,与患者病理分期、病理分级、淋巴结转移、神经浸润有关,CHRM3阳性表达率升高是肝门部胆管癌患者不良预后的独立危险因素。

M3受体遗传变异与血压钠钾反应性的关联研究

目的M3毒蕈碱乙酰胆碱受体(M3受体)由CHRM3基因编码,广泛分布于心血管系统并发挥重要的心脏调节作用。本研究旨在探讨M3受体遗传变异与钠钾饮食干预后血压反应性之间的关系。方法从中国陕西省农村地区招募来自124个家庭的333名受试者,经过3 d的基线观察后,依次进行7 d低盐饮食、7 d高盐饮食、7 d高盐补钾饮食。选取13个CHRM3基因单核苷酸多态性(SNP)位点进行相关分析。结果CHRM3基因SNP位点rs10802811与低盐期及高盐期舒张压及平均动脉压反应性显著相关,而rs6429147、rs373288072、rs114677844、rs663148与高盐期收缩压及平均动脉压反应性显著相关。此外,rs6692904与高盐补钾期收缩压、舒张压及平均动脉压反应性显著相关。结论M3受体基因多态性与血压钠钾反应性相关,提示M3受体基因可能参与血压盐敏感性及钾敏感性的形成。

糖尿病大鼠精囊组织中神经生长因子和胆碱能M3受体的变化

目的:观察糖尿病大鼠精囊组织中神经生长因子(NGF)和胆碱能毒蕈碱M3受体含量的变化,以探讨糖尿病自主神经病变对精囊的影响,为糖尿病不育的临床防治提供理论依据。方法:成年雄性普通级SD大鼠15只,随机分为正常对照组5只和糖尿病模型组10只。链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病模型成功后饲养8周,取精囊组织进行苏木精-伊红(HE)染色和免疫组化染色。结果:与正常对照组相比,糖尿病模型组HE染色可见大鼠精囊平滑肌细胞减少,腺上皮胞质变薄,结构紊乱。免疫组织化学染色显示,糖尿病模型组NGF阳性强度明显增强,而M3受体则明显减弱,糖尿病模型组与正常对照两组间NGF和M3平均累积光密度(IA)[0.018 7±0.002 4 vs 0.010 0±0.001 5和0.020 9±0.008 5 vs 0.041 2±0.011 7]的差异均具有统计学意义(P均<0.01)。结论:NGF和M3受体在糖尿病鼠精囊中表达改变,提示糖尿病可致精囊自主神经病变。

激活M_3受体减轻CoCl_2诱导的大鼠心肌细胞系H9c2低氧损伤

目的探讨卡巴胆碱(CCH,毒蕈碱受体亚型3特异性激动剂)激活毒蕈碱受体亚型3(M_3-mAChR)在氯化钴(CoCl_2)诱导的大鼠心肌细胞系H9c2低氧损伤中的作用及机制。方法正常大鼠心肌细胞系H9c2作为对照组,利用CoCl_2建立低氧损伤模型,选用M_3受体特异性激动剂CCH及其特异性阻断剂4-二苯乙酰氧基-N-甲基-哌啶甲碘化物(4-DAMP)对低氧损伤组进行干预。噻唑蓝比色法(MTT)检验细胞增殖活力;流式细胞计量术检测细胞凋亡;Western blot检测M_3受体、HIF-1α、HO-1和caspase-3蛋白表达水平。结果低氧模型组细胞凋亡率显著增高(P<0.01),细胞增殖显著降低(P<0.01);HIF-1α、caspase-3和HO-1蛋白表达水平显著上调(P<0.01)。用CCH干预后细胞凋亡率明显下降(P<0.01),细胞增殖活力明显增加(P<0.01);M_3受体、HIF-1α和HO-1蛋白表达水平显著上升(P<0.01);caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。应用4-DAMP干预后,由CCH介导的上述相关作用被抑制。结论 CCH激活M_3受体抑制CoCl_2诱导的大鼠心肌细胞系H9c2的低氧损伤,机制可能与HIF-1α和HO-1的蛋白表达水平上调有关。

益气养阴祛瘀方对干燥综合征NOD小鼠颌下腺AQP5、M3R表达的影响

目的研究益气养阴祛瘀方(黄芪、生地黄、玄参、丹参、益母草等)对干燥综合征NOD小鼠颌下腺水通道蛋白5(AQP5)以及毒蕈碱样胆碱能受体3(M3R)表达的影响。方法将30只NOD小鼠随机分为5组:模型组、西药组(硫酸羟氯喹60 mg·kg^(-1))及益气养阴祛瘀方低、中、高剂量组(11.147、22.295、44.590 g·kg^(-1)),每组6只。每日灌胃给药1次,连续给药8周。给药后第0、4、8周连续测量小鼠每日饮水量;给药结束后,分离小鼠双侧颌下腺并称定其质量,计算小鼠颌下腺指数;采用HE染色法进行颌下腺组织病理学观察,计算灶性指数评分;RT-qPCR法检测小鼠颌下腺组织AQP5、M3R mRNA表达水平;Western Blot法检测小鼠颌下腺组织AQP5、M3R蛋白表达水平;免疫组化法检测颌下腺组织AQP5蛋白表达水平;ELISA法检测血清干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素10(IL-10)含量。结果给药前,与模型组比较,益气养阴祛瘀方低、中、高剂量组及西药组NOD小鼠的日饮水量无明显变化(P>0.05);给药第4、8周,与模型组比较,益气养阴祛瘀方低、中、高剂量组及西药组NOD小鼠的日饮水量均显著减少(P<0.01)。模型组小鼠颌下腺淋巴细胞浸润明显并形成较多浸润灶;与模型组比较,益气养阴祛瘀方低、中、高剂量组及西药组NOD小鼠的颌下腺淋巴细胞浸润情况得到明显改善,浸润灶数量明显减少,灶性指数评分显著降低(P<0.01),颌下腺组织AQP5、M3R蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),血清IL-10水平明显升高(P<0.05,P<0.01);益气养阴祛瘀方高剂量组和西药组NOD小鼠的颌下腺指数明显升高(P<0.05);益气养阴祛瘀方中、高剂量组和西药组NOD小鼠颌下腺组织AQP5、M3R mRNA表达明显上调(P<0.05,P<0.01),血清IFN-γ含量显著降低(P<0.01)。结论益气养阴祛瘀方对NOD小鼠唾液腺损伤具有改善作用,可能通过上调AQP5、M3R表达,抑制颌下腺淋巴细胞浸润,改善唾液分泌功能,从而减缓干燥综合征进程。

酸甘化阴法对NOD小鼠唾液腺中AQP5、M3R及外周血干燥综合征特异性抗体的影响

目的探讨酸甘化阴法对NOD小鼠唾液腺中水分子通道蛋白-5(AQP5)、毒蕈碱受体3(M3R)及外周血干燥综合征特异性抗体的影响。方法将8周龄NOD小鼠随机分为5组,每组15只。适应性饲养1周后,芍药甘草汤低、中、高剂量组分别给予相应浓度芍药甘草汤19.5 g/kg灌胃,同时给予生理盐水腹腔注射,1次/d;毛果芸香碱组给予毛果芸香碱注射液1.4 mg/kg腹腔注射,1次/d;生理盐水组给予生理盐水灌胃,1次/d。各组均连续干预6周后取颌下腺,HE染色观察病理形态,real-time PCR法检测腺体内AQP5和M3R mRNA表达情况;取血清,采用ELISA法检测血清中抗SSA、SSB、M3R、α-Fodrin抗体含量。结果生理盐水组和毛果芸香碱组NOD小鼠颌下腺淋巴细胞浸润明显,芍药甘草汤各剂量组小鼠淋巴细胞浸润灶较少。芍药甘草汤各组AQP5及M3R mRNA相对表达量和血清中抗M3R抗体含量均明显高于生理盐水组(P均<0.05),血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗体含量均明显低于生理盐水组(P均<0.05);芍药甘草汤中剂量组AQP5及M3RmRNA相对表达量均明显高于芍药甘草汤低剂量组(P均<0.05),且AQP5 mRNA相对表达量明显高于芍药甘草汤高剂量组(P均<0.05)。芍药甘草汤中、高剂量组血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗体含量均明显低于芍药甘草汤低剂量组(P均<0.05),且芍药甘草汤高剂量组均明显低于芍药甘草汤中剂量组(P均<0.05);芍药甘草汤中、高剂量组血清中抗M3R抗体含量均明显高于芍药甘草汤低剂量组(P均<0.05),且芍药甘草汤高剂量组明显高于芍药甘草汤中剂量组(P<0.05)。结论酸甘化阴法可上调NOD小鼠唾液腺中AQP5和M3R的表达,降低血清中抗SSA、SSB、α-Fodrin抗体含量,从而改善腺体分泌能力,缓解口干症状。

小细胞肺癌中M3R的表达及意义

目的观察毒蕈碱胆碱受体3(muscarinic cholinergic receptor 3,M3R)在小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)中的表达,探讨M3R表达与SCLC分期及临床病理特征的相关性。方法采用免疫组化SP两步法检测60例SCLC(局限期和广泛期各30例)癌组织中M3R的表达,与正常肺组织对比观察M3R表达的差异;回顾性分析所有SCLC病例的病史、体征、支气管镜、胸部CT、颅脑CT、骨扫描、腹部CT等检查,电话随访患者的生存时间。结果 M3R在SCLC中的表达明显高于正常肺组织;M3R在局限期和广泛期SCLC中的表达差异无统计学意义;M3R表达与患者年龄、性别、淋巴结转移无关,与是否吸烟有关;Kaplan-Meier生存曲线显示:M3R阴性者的生存期较阳性者长,差异有统计学意义。结论 SCLC癌组织中M3R的表达水平明显高于正常肺组织,M3R表达与SCLC预后有相关性。

限制性内切酶策略鉴定CRISPR/Cas9介导的Chrm3基因敲除小鼠

CRISPR/Cas9技术是近年发展起来的快速基因编辑技术。通过该技术已对多种生物的基因组进行了编辑。由此产生的基因编辑动物的建系与鉴定是随之而来较为繁琐的工作。单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA)靶序列的设计和确定不仅影响后续靶向基因组的效率,还可作为优化鉴定、筛选方法的参考。本研究在选取sgRNA靶序列时,不仅依据软件的评分,还分析了sgRNA靶序列是否含有酶切位点,以便对后续纯合子/杂合子进行鉴定。结果显示,以特异引物扩增的野生型小鼠Chrm3基因片段可被限制性内切酶BanⅡ切为两个片段;而纯合子小鼠"丢失"该酶切位点,其PCR产物不能被切开;杂合子小鼠PCR产物被不完全切开,凝胶电泳结果可见三条带。本研究结果提示该策略可有效简化基因编辑动物建系鉴定工作,提高鉴定效率及改善阳性动物辨识效果。

毒蕈碱胆碱受体3在肺癌的研究进展

毒蕈碱胆碱受体3（M3受体）在多种肿瘤组织均有表达，并与多种细胞重要信号通路相关联，在肿瘤的增殖、侵袭、转移等方面起到重要作用；同时，M3受体参与多种肺部疾病如COPD的病理生理过程。近年来，M3受体在肺癌中的研究受到较大的重视，M3受体有可能成为肺癌预防治疗的新靶点。

M3R激动剂通过激活PI3K/AKT信号途径促进肺癌细胞A549的上皮间质转化

目的:探讨毒蕈碱胆碱受体3(muscarinic receptor 3,M3R)激动剂卡巴胆碱促进人肺癌A549细胞上皮间质转化的可能信号通路。方法:用400μmol/L卡巴胆碱刺激人肺癌A549细胞,在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化,应用划痕愈合实验和Transwell实验观察细胞迁移和侵袭能力;应用q PCR技术检测上皮间质转化相关蛋白波形蛋白(vimentin)和E钙黏蛋白(E-cadherin)m RNA水平的变化;应用Western blot技术检测p-AKT、vimentin和E-cadherin蛋白水平的变化。结果:卡巴胆碱刺激人肺癌A549细胞后,细胞形态发生明显改变,由不规则多边形逐渐向梭形转化、细胞间紧密结合逐渐变得松散,细胞迁移和侵袭能力增强;vimentin的m RNA和蛋白表达量明显增加,E-cadherin的m RNA和蛋白水平降低,磷酸化的AKT蛋白水平增加,且这些变化均可被M3R特异性抑制剂4-DAMP所抑制(P<0.05)。结论:卡巴胆碱可通过激活PI3K/AKT信号途径促进人肺癌A549细胞发生上皮间质转化。

ChRM3对胆管癌神经浸润的影响

目的探讨毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3(ChRM3)对胆管癌神经浸润的影响。方法采用免疫组织化学方法检测60例胆管癌组织及30例正常胆管组织中ChRM3的表达水平;建立小鼠背根神经节(DRG)与胆管癌细胞RBE体外共培养模型,并加入ChRM3激动剂(匹罗卡品)及其拮抗剂(阿托品),通过观察神经纤维的生长和胆管癌RBE细胞对DRG和周围神经纤维的黏附及浸润,检测ChRM3在匹罗卡品和阿托品作用下对胆管癌RBE细胞浸润DRG及周围神经纤维的影响。结果 ChRM3在胆管癌组织中的阳性表达率高于正常胆管组织,差异有统计学意义(P<0.01)。神经浸润在胆管癌中发生率为91.7%(55/60)。DRG-RBE细胞共培养模型中加入匹罗卡品后,RBE细胞浸润DRG及周围神经纤维的细胞数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),这种作用在加入阿托品后明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。而将阿托品单独作用于胆管癌组织,神经浸润结果与对照组比较无明显差异(P>0.05)。结论 ChRM3参与了胆管癌神经浸润过程,可能为抑制胆管癌的神经浸润提供了新治疗靶点。