戊乙奎醚光学异构体与毒蕈碱型受体亚型的分子对接研究

目的:研究戊乙奎醚光学异构体对毒蕈碱型(M)受体亚型的亲和性,为揭示戊乙奎醚的作用靶点及药效选择性提供参考。方法:利用同源建模和分子对接等分子模拟技术,通过比较戊乙奎醚不同光学异构体R1(3R,2′R)、R2(3R,2′S)、S1(3S,2′R)和S2(3S,2′S)与M受体亚型M_1~M_5的结合能,判断其与M受体亚型的亲和性。结果:戊乙奎醚4个光学异构体均能够对接到M受体各亚型的活性位点,不同异构体与不同M受体亚型的分子对接显示出较大差异。4个光学异构体与M_3受体具有较大的结合能,在5 736.519~5 907.143 kcal/mol之间;R1与M_1的结合能为1 190.04 kcal/mol;而其他光学异构体与各受体亚型的结合能较低或为负数。结论:戊乙奎醚的异构体R1对M_1受体具有亲和性,4个光学异构体均对M_3受体具有亲和性。

NOS抑制剂和MK-801对吗啡依赖大鼠脊髓和脑干毒蕈碱型受体表达的影响

目的 观察NMDA受体拮抗剂和NOS抑制剂对吗啡依赖大鼠毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型表达的影响。方法 RT PCR方法检测m1 5mRNA水平。结果 吗啡依赖大鼠脊髓注射纳洛酮 1h后脊髓m1 、m2 、m3和m4 及脑干m1 表达较依赖组减少 ,MK80 1 (0 .1 2 5mg·kg- 1 )处理后脊髓m2 、m3和m5以及脑干m2 和m5表达增加 ,脊髓和脑干m1 和m4 表达减少 ;NOS抑制剂L NAME(1 0mg·kg- 1 )处理后脊髓和脑干m1 、m3、m5受体表达减少。结论 NMDA受体拮抗剂以及NOS抑制剂对M受体亚型基因调控是控制戒断症状的机制之一。

毒蕈碱型胆碱能受体M3调控肝癌细胞侵袭转移的研究

目的探讨毒蕈碱型胆碱能受体M3(muscarinic cholinergic receptors 3,ChRM3)活化对人肝癌细胞侵袭、转移能力的影响及其分子机制。方法 Western blot检测两种人肝癌细胞株Hep G2和SMMC-7721中ChRM3受体的表达;采用氯贝胆碱(Beth)及达菲那新(UK88525)处理肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞,分为空白对照组、Beth组、Beth+UK88525组、UK88525组,经处理48 h后,Transwell实验检测两种肝癌细胞经不同分组处理后侵袭、迁移能力的变化,Western blot检测各组细胞中上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)标志蛋白的表达及下游信号通路PI3K/Akt的变化;采用shRNA干扰质粒经Lipofectamine 2000TM转染肝癌细胞Hep G2以沉默ChRM3,分为空白对照组、Beth组、Beth+sh ChRM3组、sh ChRM3组,分别检测细胞的侵袭、转移能力及EMT、下游PI3K/Akt的改变。结果 Hep G2和SMMC-7721两种肝癌细胞中均有ChRM3受体的表达;Transwell实验显示:Beth单独处理组对肝癌细胞的迁移和侵袭有明显的促进作用,而UK88525能够抑制Beth对肝癌细胞迁移侵袭能力的促进作用(P<0.05);Western blot结果显示:Beth单独处理组能够上调EMT标志蛋白N-Cadherin和Vimentin,下调E-Cadherin的表达,UK88525处理后能够明显抑制Beth促进Hep G2细胞EMT的过程(解除Beth对Hep G2细胞EMT的促进过程),同时也能够抑制PI3K/Akt的活化(P<0.05);干扰质粒沉默ChRM3受体同样能够抑制Beth促肝癌细胞迁移、侵袭的作用,并且抑制Beth诱导的EMT和下游PI3K/Akt的活化(P<0.05)。结论 ChRM3活化能够通过PI3K/Akt信号通路促进肝癌细胞的侵袭和转移。

毒蕈碱型M5受体亚型及生物学特性

M5是最后一个被克隆出的乙酰胆碱毒蕈碱型受体亚型,具有G蛋白偶联受体家族的基本结构特征, 其信号转导方式既可以与G蛋白偶联,激活多种效应酶 (腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2 )产生相应的生物学效应,又可作用于离子通道来调节细胞间的信号传递。M5生理作用主要与调节中枢NO的生成和DA的释放有关,可能为药物滥用成瘾、DA系统功能障碍性疾病、阿尔采末病、脑缺血等的药物治疗提供一个新靶标。

良性前列腺增生合并膀胱过度活动症患者膀胱黏膜毒蕈碱型胆碱能受体M2、M3亚型的表达及临床意义

目的探讨良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）合并膀胱过度活动症（overac tivebladder，OAB）患者膀胱黏膜毒蕈碱型胆碱能受体（muscarinic cholinergic receptor，M受体）M2、M3亚型表达水平的变化及临床意义。方法分析2012年5月～2013年3月20例BPH患者的国际前列腺症状评分（international prostate syndrome scoring，IPSS）、生活质量评分（quality oflife，QOL）、膀胱过度活动症症状评分（OAB syndrome scoring，OABSS）和尿动力学检查。根据OABSS评分结果将其分为BPH组（9例）及BPH并OAB组（11例）。2组均在膀胱镜下钳取膀胱黏膜，经逆转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerase chainreaction，RT-PCR）检测M受体M2、M3亚型mRNA的表达水平。M2、M3受体mRNA表达水平采用相对于内参基因mRNA表达的相对值△Ct值表示。比较2组M2、M3受体表达水平及相关性。结果M2、M3受体表达的ACt值BPH组明显低于BPH并OAB组（M2的△Ct值：-0．1544±0．641VS．0．5624±0．762，t=-2．241，P=0．038；M3的△Ct值：2．5344±0．816VS．3．6394±1．019，t=-2．630，P=0．017），说明BPH组M2、M3表达水平均高于BPH并OAB组。2组M2；M3分别为中位数6．5206（2．35～17．33）和7．9447（2．10～23．83）（Z=-1．102，P=0．271）。同组比较，2组M3表达水平均高于M3（t=-7．776，P=0．000；t=-8．018，P=0．000）。M3表达水平与OABSS和QOL评分呈负相关（r=-0．466，P=0．039；r=-0．496，P=0．026）。结论BPH合并OAB症状的患者，其膀胱黏膜M2、M3表达水平下降，且M2：M3比例在合并OAB后有升高的趋势，在OAB发病中起一定作用。M3表达的下降，加重了OAB的程度，降低了患者的生活质量。

Ca^(2+)参与蚕豆保卫细胞中毒蕈碱型受体介导的乙酰胆碱信号转导

动物神经递质乙酰胆碱(ACh)也存在于植物体内, 并发挥多种重要生理功能. 一定浓度的ACh可诱导气孔开放. 以Ca2+荧光指示剂Fluo-3AM为探针, 利用激光共聚焦扫描显微镜观察ACh调控气孔运动中保卫细胞胞质Ca2+的动态变化. 结果证明, 外加ACh促使保卫细胞胞质Ca2+的瞬时增加. 毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR)的激活剂毒蕈碱与ACh的作用类似, 也能激活胞质Ca2+的瞬时增加; 反之, 毒蕈碱型受体的抑制剂阿托品预处理则抑制ACh诱导的Ca2+增加, 这与动物中mAChR的作用机制类似. 用EGTA螯合胞外Ca2+或用钌红阻断液泡Ca2+的释放, 结果表明ACh诱导的保卫细胞胞质Ca2+增加主要来源于胞内Ca2+库的Ca2+释放. 研究表明, 经过mAChR介导, Ca2+参与保卫细胞响应ACh刺激的信号转导.

昆虫毒蕈碱型乙酰胆碱受体的分子进化、功能及药理学研究

毒蕈碱型乙酰胆碱受体(muscarinic acetylcholine receptor,mAchR)是昆虫神经系统中一种十分重要的神经递质受体,属于G蛋白偶联受体超家族,与配体结合后激活G蛋白并通过胞内第二信使产生生物学效应,参与昆虫多种神经生理功能,是农药开发的一个潜在靶标。昆虫毒蕈碱型乙酰胆碱受体的研究,有助于提高昆虫神经生理及行为调节机制等方面的认识,并为以此为靶标的新型杀虫剂研制提供新思路。本文综述了国内外对昆虫毒蕈碱型乙酰胆碱受体的研究概况,并对GenBank中已上传的昆虫mAchR序列进行了分子进化分析,最后对昆虫mAchR研究中存在的问题及前景进行了分析和展望。

原发性干燥综合征患者毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型3及其受体的变化及临床意义

目的了解毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型3(muscarinic acetylcholine receptor M3,CHRM3)及毒蕈碱型乙酰胆碱受体3亚型抗体(M3 muscarinic acetylcholine receptor antibody,CHRM3-Ab)在原发性干燥综合征(primary Sjgren’s syndrome,pSS)发病过程中的可能作用。方法川北医学院附属医院风湿科2010年4月至2011年12月门诊及住院pSS患者43例为pSS组,同期29名健康体检女性为正常对照组。收集两组临床资料及实验室指标。实时荧光定量聚合酶链式反应检测pSS患者及健康体检者外周血单个核细胞CHRM3转录水平,酶联免疫吸附试验检测血浆CHRM3-Ab浓度,进行CHRM3转录水平、CHRM3-Ab与临床指标的相关性分析。结果 pSS组CHRM3转录水平与CHRM3-Ab浓度显著高于正常对照组,差异均有统计学意义[(0.00014±0.00030)vs(0.00009±0.00004),P<0.05;(227.29±154.81)pmol/Lvs(141.44±71.04)pmol/L,P<0.01]。Spearman相关性分析发现,pSS患者CHRM3-Ab浓度与血细胞沉降率及IgG均呈负相关(r分别=-0.452、-0.470,均P<0.05)。结论 CHRM3转录水平和CHRM3-Ab在pSS患者的高表达可能在疾病发生发展中发挥重要作用;CHRM3-Ab可能通过与CHRM3非竞争性结合而抑制乙酰胆碱与其受体作用,导致腺体分泌减少。加强对CHRM3和CHRM3-Ab研究,有望为诊治pSS带来新契机。

海马胆碱能神经刺激肽通过活化3型毒蕈碱受体促进INS-1细胞胰岛素释放

目的明确海马胆碱能神经刺激肽(HCNP)对INS-1细胞胰岛素分泌影响,并对其可能作用的毒蕈碱样胆碱能受体途径进行分析。方法 INS-1细胞随机分为3组:对照组、HCNP组、HCNP+佛波酯(PMA)组。对照组给予RPMI 1640液培养,HCNP组给予人工合成HCNP(50 pg/ml)与RPMI 1640液共培养,HCNP+PMA组予人工合成HCNP与RPMI 1640液共培养后,行胰岛素释放前18 h加入PMA(10 nmol/L);应用放射免疫方法检测各组不同浓度葡萄糖培养液中胰岛素含量。实时定量PCR检测对照组、HCNP组HCNP前体蛋白(HCNP-pp)、胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)、3型毒蕈碱样受体(3-typemuscarinic receptor,M3R)基因水平表达情况。结果浓度为3.3 mmol/L葡萄糖,三组间胰岛素含量无明显差异。浓度为5.6mmol/L、16.7 mmol/L葡萄糖作用下,HCNP组胰岛素含量均高于对照、HCNP+PMA组,差异具有统计学意义。HCNP组INS-1细胞HCNP-pp、ChAT、M3R三者mRNA含量均高于对照组,差异具有统计学意义。结论 HCNP通过提高ChAT活性,推测影响乙酰胆碱合成,进一步活化M3R,促进胰岛素分泌,PMA可阻断此作用。

脊髓毒蕈碱型乙酰胆碱能受体介导吗啡依赖的神经生物学机制

作者在临床应用东莨菪碱成功治疗8000例海洛因依赖者的基础上系统研究了毒蕈碱型乙酰胆碱能受体(M)受体介导吗啡依赖神经生物学的机制.M受体拮抗剂减轻海洛因依赖者的戒断症状和吗啡依赖大鼠或猴纳络酮激发的戒断症状,提示M受体在阿片依赖中发挥重要作用.

西方蜜蜂毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因的生物信息学分析

利用生物信息学方法分析了西方蜜蜂Apis mellifera毒蕈碱型乙酰胆碱受体的核酸和氨基酸序列,并对其组成成分、疏水/亲水区、跨膜拓扑结构域、分子系统进化关系进行了预测和推断。结果显示,该受体定位在第8条染色体上,由618个氨基酸组成,分子量69906.5D,等电点(pI)8.56;是G蛋白偶联型受体,含N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、cAMP/cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点。

洛伐他汀对大鼠海马神经元毒蕈碱样型乙酰胆碱受体的影响及与ERK信号通路的关系

目的:观察洛伐他汀对大鼠原代海马神经元毒蕈碱样型乙酰胆碱受体(mAChRs)及细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路的作用。方法:选择大鼠原代培养海马神经细胞,(1)将细胞分为对照组、Atropine处理组及U0126处理组,观察mAChRs拮抗剂Atropine及ERK1/2通路抑制剂U0126对M1 mAChR和ERK1/2信号通路的影响;(2)将细胞分为对照组、Atropine及洛伐他汀处理组、洛伐他汀组、U0126及洛伐他汀处理组,观察洛伐他汀联合Atropine或U0126对M1 mAChR和ERK1/2信号通路的影响;采用蛋白印迹法(Western blotting)检测M1 mAChR、总ERK1/2(p-ERK1/2)及磷酸化ERK(phospho-ERK1/2)蛋白表达水平。结果:(1)与对照组相比,Atropine和U0126分别处理细胞后,phospho-ERK1/2蛋白表达水平明显降低(P<0.05),M1 mAChR和pERK1/2表达水平未见明显改变;(2)与对照组相比,0.1μmol/L洛伐他汀处理神经细胞,M1 mAChR及phosphoERK1/2蛋白表达水平明显增高(P<0.05);与洛伐他汀处理组相比,联合应用洛伐他汀与Atropine处理细胞,M1 mAChR及phospho-ERK1/2蛋白表达水平的升高未受到明显影响,但联合应用洛伐他汀与U0126处理细胞,phospho-ERK1/2蛋白表达水平明显下降(P<0.01),M1 mAChR的升高未受到明显影响。结论 :洛伐他汀能够活化ERK1/2信号通路,并上调mAChRs表达水平,但洛伐他汀上调mAChRs表达水平的作用与ERK1/2信号通路无关。

洛伐他汀上调体外培养神经细胞毒蕈碱型乙酰胆碱受体及对抗β-淀粉样肽对该受体表达的抑制作用

目的观察洛伐他汀是否对毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChRs)有上调作用,探讨其是否具有抗β-淀粉样肽(Aβ)的作用。方法选择原代培养的大鼠海马神经细胞和SH-SY5Y细胞,采用洛伐他汀和Aβ寡聚体(AβOs)分别或联合处理培养细胞24~48 h后,采用蛋白印迹法和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测细胞中M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表达水平。结果免疫荧光染色显示原代大鼠海马神经细胞的体外培养纯度达85%以上;不同浓度洛伐他汀处理神经细胞24 h后,M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05);0.5μmol/L AβOs处理神经细胞48 h后,其M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表达水平均明显下降(P<0.05);但预先用0.1μmol/L洛伐他汀处理神经细胞24 h,可减轻AβOs导致的M1 mAChR和M3 mAChR表达水平下降。结论洛伐他汀可能具有上调mAChRs表达水平的作用,对抗Aβ对该受体的作用。

毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3对胆管癌神经浸润的影响

目的研究毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3(ChRM3)对胆管癌神经浸润的影响。方法筛选经外科手术切除的胆管病理组织标本90例展开研究,标本均用石蜡包埋,重新筛选腺癌组织标本60例,正产胆管组织标本30例,添加不同试剂观察其对胆管癌神经浸润的影响。结果在DRG-RBE细胞共培养模型培养36 h后,浸润细胞数目明显少于添加匹罗卡品数目(P<0.05),与添加匹罗卡品拮抗剂阿托品、单独添加阿托品比较差异不明显(P>0.05)。结论ChRM3加入胆管癌神经浸润过程,能够为为抑制胆管癌的神经浸润提供新的方向。

膀胱黏膜毒蕈碱型胆碱能受体密度与前列腺术后膀胱痉挛的相关性研究

目的探讨膀胱黏膜毒蕈碱型胆碱能受体(M受体)M2、M3亚型的密度与前列腺电切术后膀胱痉挛的相关性。方法选取2012年5月-2015年5月医院收治的良性前列腺增生(BPH)患者作为研究对象,将其分为合并膀胱过度活动症(OAB)观察组和不合并OAB对照组,再将观察组分为发生膀胱痉挛组及不发生膀胱痉挛组,比较各组M2、M3受体的密度及其相关性。结果观察组术后膀胱痉挛的发生率高于对照组;观察组M2、M3受体密度均低于对照组;观察组中发生膀胱痉挛患者的M3受体密度低于不发生膀胱痉挛患者的M3受体密度。结论膀胱黏膜M3受体密度与前列腺术后发生膀胱痉挛存在相关性,提示M3受体可能参与膀胱痉挛的发病机制。

毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3在肝门部胆管癌中表达及临床意义

目的:探究毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3(CHRM3)在肝门部胆管癌中表达及其与预后的关系。方法:选取2013年1月至2017年4月本院收集的手术切除的69例肝门部胆管癌组织及69例胆管癌癌旁正常胆管组织为研究对象。采用免疫组化法测定肝门部胆管癌组织和癌旁组织中CHRM3表达情况,分析CHRM3表达水平与肝门部胆管癌临床病理特征的关系,术后随访3年探究CHRM3表达水平与肝门部胆管癌患者预后的关系。结果:CHRM3在癌旁组织和肝门部胆管癌组织阳性率分别为7.25%和84.06%,差异具有统计学意义(P<0.05)。肝门部胆管癌组织中CHRM3表达水平与年龄、性别无关(P>0.05),与病理分期、病理分级、淋巴结转移、神经浸润有关(P<0.05)。Kaplan-Meier法显示CHRM3阴性肝门部胆管癌患者平均生存时间为(33.69±0.76)个月,显著长于CHRM3阳性肝门部胆管癌患者(23.37±1.02)个月(P<0.05)。多因素分析表明,神经浸润、CHRM3阳性是肝门部胆管癌患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)。结论:CHRM3在肝门部胆管癌中阳性表达率显著上升,与患者病理分期、病理分级、淋巴结转移、神经浸润有关,CHRM3阳性表达率升高是肝门部胆管癌患者不良预后的独立危险因素。

海马M_2受体调节杏仁核内谷氨酸的释放与学习记忆的研究

目的研究海马内M1和M2受体对学习记忆功能的影响及其可能机制。方法SD大鼠分为3组,分别海马内注射等体积的M1-ASODN(M1-AS组)、M2-ASODN(M2-AS组)和生理盐水(对照组),以被动逃避反应的步入潜伏期作为衡量学习记忆功能的指标,以CZE-LIFD法检测杏仁核内游离谷氨酸的浓度。结果M1-ASODN缩短步入潜伏期,为对照组的25%(P<0.01),M2-ASODN使步入潜伏期较对照组增加了75%(P<0.05)。双侧海马内注射ASODN后与对照组相比,M2-AS组杏仁核内谷氨酸的含量增加164%(P<0.01),而M1-AS组无变化(P>0.05)。结论海马内M受体参与恐惧性记忆的调节,M2受体抑制学习记忆,M1受体促进学习记忆。海马内M2受体可能通过调节杏仁核内谷氨酸含量的变化介导被动逃避反应的记忆过程。