J、K亚群禽白血病病毒的分离和囊膜蛋白(gp85)基因序列分析

为了解现阶段我国禽白血病病毒(ALV)的流行特征和演化趋势,本试验于2021—2022年从国内某鸡场采集蛋清ALV衣壳蛋白(p27)抗原阳性的鸡血浆,接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)分离病毒并进行亚群鉴定;采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增分离株的囊膜蛋白(gp85)基因片段,并对其进行测序,将基因序列与ALV不同亚群毒株进行比对和遗传进化分析;选取氨基酸变化差异较大的分离毒株进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,共分离到7株ALV毒株(3株J亚群,4株K亚群),ALV-J分离毒株CAU4932、CAU4860和CAU2259的gp 85基因片段长度为918 bp,编码306个氨基酸,分离毒株之间gp 85基因核苷酸同源性为90.5%~95.2%,gp85蛋白氨基酸同源性为95.1%~99.3%;ALV-K分离毒株CAU7049、CAU5006、CAU7176和CAU7168的gp 85基因片段长度为1008 bp,编码336个氨基酸,分离毒株之间gp 85基因核苷酸同源性为89.4%~92.3%,gp85蛋白氨基酸同源性为94.0%~99.7%。gp85蛋白氨基酸序列同源性比对发现,分离株gp85蛋白氨基酸序列均会发生突变,但高变区hr1和hr2所占比例较多,证实了gp85的高变性。在gp85蛋白B细胞抗原表位中存在部分位点的氨基酸突变,可能导致gp85蛋白抗原性发生变化。间接免疫荧光鉴定结果显示,5株分离毒株均可在DF-1细胞内复制并存在可被抗体识别的p27抗原表位。结果表明,本试验分离的7株ALV毒株是国内ALV-J和ALV-K流行毒株的突变株,不仅丰富了ALV基因组库资源,且为后续研究ALV的遗传变异特征和流行趋势等提供参考依据。

甘肃省武威市边缘革蜱的鉴定及序列特征分析

目的通过比较甘肃省武威市边缘革蜱核糖体各片段的基因差异,确定边缘革蜱合适的分子鉴定方法。方法2022年3月采集武威市边缘革蜱128只,随机选择10只进行实验。首先使用体式显微镜对蜱进行形态学鉴定,然后扩增边缘革蜱的5.8S、18S、28S、ITS1和ITS2核糖体序列并测序比对。使用MEGA 11软件构建蜱种的系统发育树,再通过DNASTAR软件比对边缘革蜱与长角血蜱等常见蜱种的基因同源性,进行基因多态性的分析和有效标记的筛选。结果形态学鉴定结果显示所有蜱为同一种蜱,均为边缘革蜱。系统发育关系显示,核糖体18S、28S、ITS1和ITS2序列可区分革蜱属的蜱虫,5.8S序列无区分能力。同时18S和ITS1序列能将边缘革蜱与其他蜱种区分开,而且18S序列还可区分不同地域的边缘革蜱。结论核糖体18S序列可区分边缘革蜱不同的地域株,其作为鉴定边缘革蜱分子学依据的能力较强。

雀形目15种鸟类CoⅠ与Cyt b基因序列的比较

对雀形目Passeriformes6科15种鸟类线粒体DNA的Cyt b基因全序列(1143bp)和CoⅠ基因部分序列(1176bp)进行了比较,结果显示Cyt b和CoⅠ基因序列的变异位点分别为454个和366个,简约信息位点为337个和303个,而且CoⅠ基因比Cytb基因略微保守,进化速率也较低。采用邻接法、最大简约法、最大似然法和贝叶斯法分别构建了CoⅠ和Cyt b基因两组数据集的分子系统发生树及其合一树,并对建树结果进行了比较分析。基于以上两点,本文认为CoⅠ基因比Cyt b基因更适合于确定雀形目科级阶元之间的系统发生关系,而且它也能够作为雀形目物种鉴定的分子标记,但在物种鉴定方面不如Cyt b基因稳定和准确。

鸡的J亚群白血病病毒的分离及部分序列比较

通过接种鸡胚成纤维细胞、聚合酶链式反应 (PCR)技术及特异性单抗的间接荧光抗体反应 (IFA) ,从某大型肉用型种鸡场的疑似J亚群白血病的病鸡中 ,以及 2 5个临床健康的商品代肉鸡群的 2群中 ,分离鉴定出J亚群禽白血病病毒 (ALV J)。在用抗ALV Jgp85单克隆抗体JE9的IFA中 ,来自病鸡群的两株病毒SD990 1和SD990 2呈强阳性反应 ,来自临床健康肉鸡群的YZ990 1和YZ990 2株呈弱阳性反应。对YZ990 1株和SD990 2株的PCR产物直接测序结果表明 ,这二个中国株的囊膜蛋白 gp85的氨基酸组成与原型株HPRS 10 3及美国分离株ADOL Hcl有 89%～ 93%的同源性 ,它们相互间的同源性是 92 %。其 3′端LTR区与原型株HPRS 10 3则有 95 %～ 97%的同源性 ,但中国的两株病毒在紧靠 3′端LTR的“E”成分中 ,出现了一个 139个碱基的缺失性突变 ,而代之以一个 11个碱基的插入序列。

笛鲷属(Lutjanus)鱼类线粒体16S rRNA基因序列比较及系统学分析

对笛鲷属9种鱼的线粒体DNA16S rRNA基因片段进行了PCR扩增,扩增产物经纯化后测序,得到了长度为561bp的分析序列。结合GenBank中的另外9种笛鲷的16S rRNA同源序列计算得出A、T、G、C的含量平均为28.5%、22.1%、23.6%和25.8%,AT含量稍高于GC含量,18种笛鲷碱基组成差异不大。利用MEGA3.1软件对所得序列进行比对后检测到72个变异位点,其中包括简约信息位点44个,在变异位点中75.61%的碱基替换是由于发生了转换,转换/颠换平均为3.1︰1。计算了种间的遗传距离,结果表明,序列差异在0.0193-0.0680之间,其中勒氏笛鲷和金焰笛鲷、勒氏笛鲷和金带笛鲷的序列差异最小,而红鳍笛鲷和金焰笛鲷、红鳍笛鲷和画眉笛鲷的序列差异最大。选用高体四长棘鲷(Argyrops spinifer)为外群,利用NJ法构建了分子系统树,结果表明:本研究中的9种南海笛鲷与其它9种笛鲷进化关系较远;并且南海9种笛鲷相互之间仍然保持着着相对较远的遗传距离,遗传多样性较好。

苦荞和甜荞查尔酮合成酶基因的克隆及序列比较

以苦荞品种‘西农9920’和甜荞品种‘西农9976’为材料,根据其它植物查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因DNA序列的保守区域设计的一对简并引物,进行PCR扩增,从2种荞麦基因组中克隆出了长度均为860 bp的CHS基因片段,对其进行回收、克隆,挑选阳性克隆测序;序列分析表明这2个片段含有CHS基因的N端和C端的结构域,分别为苦荞和甜荞的CHS基因片段,命名为FtCHS和FeCHS。对获得的2种荞麦CHS基因的DNA序列进行比较分析,发现两者间存在多达43处单碱基多态性,这些单碱基多态性可能是苦荞和甜荞种子中类黄酮含量差异的重要原因之一。苦荞和甜荞CHS与其它植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明,其与同为蓼科的掌叶大黄和石竹科的满天星的同源性较近。

4种胡蜂前溶血肽原基因的克隆与序列比较

从雌性亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂毒腺中抽提总RNA ,通过RT PCR方法扩增得到 4种胡蜂蜂毒前溶血肽原的cDNA ,再将扩增产物克隆到pGEM Teasyvector上。测序结果表明 :扩增得到的片段长度均为2 13bp ,系蜂毒前溶血肽原编码区的cDNA。经序列比较 ,4种胡蜂蜂毒前溶血肽原之间的氨基酸序列同源性都超过95 %。亚非马蜂、额斑黄胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂各自与意大利蜜蜂蜂毒前溶血肽原氨基酸序列的同源性分别为95 8%、10 0 %、97 2 %、97 2 %。结果表明 :蜂毒前溶血肽原一级结构序列具有很高的保守性 ,尽管胡蜂和蜜蜂属于膜翅目不同的总科 。

企鹅珍珠贝热休克蛋白70基因的克隆与序列比较分析

采用同源克隆和锚定PCR技术,从企鹅珍珠贝Pteria penguin中克隆到热休克蛋白hsp70基因的cDNA全序列。cDNA全长2 308 bp,3’非编码区域(UTR)为234 bp,5’UTR为118 bp,开放阅读框(ORF)为1 956 bp,编码651个氨基酸,分子量为70.97 kd,理论等电点为5.24,有2个糖基化位点:NKSI和NVSA,并含有HSP70家族的3个签名序列:IDLGTTYS,DLGGGTFD和IVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端的保守序列EE-VD。结合BLAST分析的结果,可以确认获得的cDNA序列为企鹅珍珠贝HSP70的编码序列。与合浦珠母贝Pinctada fucata hsp70的氨基酸序列相比,企鹅珍珠贝多1个糖基化位点NVSA,少1个氨基酸,包括1个氨基酸插入和2个缺失。两者的氨基酸序列一致性高达92%,突变位点52个;两者的核苷酸序列一致性高达79%,突变位点416个。系统发育分析表明两者的亲缘关系最近,与传统分类相符,然后与太平洋牡蛎等聚合在一起。该基因的克隆和比较分析为进一步深入研究珍珠贝类的抗逆机理、抗性育种及其进化具有重要意义。

黄瓜花叶病毒萝卜分离株卫星RNA的克隆及其与12个卫星RNA核苷酸序列的比较

对一株分离自萝卜 ( Raphanus sativus)的黄瓜花叶病毒 ( CMV)卫星 RNA( Rs)进行了 c DNA克隆与序列确定 ,并与 12个已知的卫星 RNA序列进行了比较 .结果表明 :卫星 RNA Rs的大小为 368nt;该卫星 RNA所比较的 13个卫星 RNA的大小分布为 334～ 4 0 5nt,可分为 3个组和 4个亚组 ;CMV卫星 RNA的序列同源性和分组与卫星 RNA的大小并无直接联系 .卫星 RNA序列之间的连续缺失和插入均集中在 90～ 2 55nt间几个邻近的区域 .在卫星 RNA二级结构中的非配对区序列、卫星 RNA的 5'端近 80个碱基和 3'端近 4 5个碱基相当保守 .由此推测 CMV卫星 RNA的理论长度可达 4 4 6nt.序列结构的比较显示 ,CMV卫星 RNA具有作为外源基因载体的潜力 .

6种笛鲷属鱼类Cyt b基因片段序列的比较

采用聚合酶链式反应直接测序法,获得紫红笛鲷(Lutjanusargentimaculatus)、白星笛鲷(L.stellatus)、千年笛鲷(L.sebae)、勒氏笛鲷(L.russelli)、红鳍笛鲷(L.erythropterus)5种笛鲷属鱼的线粒体细胞色素b(Cytb)425bp序列,并结合基因库中的斜带笛鲷(L.decussatus)Cytb同源序列进行比较分析,共发现88个核苷酸位点存在变异(20.7%)。用MEGA2.1软件中的Pairwisedistance工具计算了6种笛鲷属鱼类的相对遗传距离,表明6种笛鲷属鱼类的序列差异在0.096—0.129之间,其中红鳍笛鲷和紫红笛鲷序列差异最大为0.129,千年笛鲷与红鳍笛鲷的序列差异最小为0.096;序列变异的转换/颠换比值较低,平均只有2.160。

4种海参16S rRNA和COI基因片段序列比较及系统学研究

采用PCR技术对来自山东荣成、长岛、俄罗斯和日本的刺参(Apostichopus japonicus),来自澳大利亚的黄乳海参(Holothuria fuscogilva),来自冰岛的北大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)和来自福建的二色桌片参(Mensamaria interce-dens)的16SrRNA和COI基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度约为500bp和540bp的片段。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数进行基因序列变异分析。结果表明,根据16SrRNA、COI基因片段进行刺参种内差异比较时,长岛和荣成刺参序列差异最小,和日本刺参序列差异最大;刺参和其他科3种海参种间的序列差异远远高于刺参种内差异。从GenBank中选取7条海参序列与本研究所测序列一同构建了NJ和ME系统树。根据2种基因片段的系统学分析均表明,刺参属和拟刺参属亲缘关系很近,可能有共同的起源。而海参科未与同属于楯手目(Aspidochirolida)的刺参科聚类,而与枝手目瓜参科和沙子鸡科聚为一支,与形态学的分类不一致。

特超强毒648株马立克氏病病毒的囊膜糖蛋白gE基因的克隆和序列比较

鸡马立克氏病毒特超强毒 (vv+MDV) 648株的囊膜糖蛋白 gE基因经PCR扩增并克隆入pUC1 8载体。 648株gE基因经核酸序列分析测定 ,全长为 1 494碱基。所编码的蛋白具有跨膜糖蛋白的一些特征。它含有 8个潜在的糖基化位点、N端有一段疏水区 (1～ 1 9aa)所构成的信号肽、C端有一段疏水区 (391～ 41 9aa)所构成的膜锚着序列。经 648株 (vv+MDV)和马立克氏病毒强毒 (vMDV)GA株的 gE相比较 ,在MDV血清 1型中 gE是较为保守的 ,二者仅有 2个核苷酸的差异 (第 51 2位、第 1 472位 ) ,并导致了有二个相应的氨基酸的改变 (第1 71位Leu/Pro、第 491位Arg/Lys)。

两株马立克病病毒的分离及相关致病基因序列的比较

为了解国内鸡群马立克病（MD）流行毒株的遗传特征,采用细胞培养、间接免疫荧光等方法从江苏省2个鸡场送检病鸡中分离鉴定出2株马立克病病毒（MDV）Ⅰ型毒株,采用PCR方法扩增两分离毒株的vIL-8、pp38、meq等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比较分析。结果显示,两分离毒株的序列同源性为99.7%-100%,与MDVⅠ型强毒及超强毒株的同源性为99.3%-99.8%,具有强毒特征;两分离毒株的meq基因与其他4个国内分离强毒株的序列完全一致,在pp38基因编码的氨基酸序列中第109位均为甘氨酸而不是国外GA等毒株的谷氨酸,这与以前报道的另外3个中国野毒株一致。提示,这些变异可能是国内MDV流行强毒的遗传性特征。

第46代鸡贫血病病毒细胞凋亡素基因的体外扩增、克隆、序列比较

通过聚合酶链式反应 (PCR)扩增了第 46代鸡贫血病病毒 (CAV)Cux株的细胞凋亡素 (Apoptin)基因 ,并克隆入pGEX_5X_3质粒载体中。通过限制性内切酶分析、序列测定 ,验证了克隆的正确性。细胞凋亡素基因全长为 36 3bp ,编码 12 1个氨基酸。与Meehan .等发表的CAVCux株序列相比 ,第 46代细胞适应毒的细胞凋亡素基因的第 2 0 9个核苷酸由CT ,与澳大利亚株、美国株CAV序列分别有 5个和 2个碱基的差别 ,并且均匀分布在 5’端前 2 10碱基区 ,而在 3’端序列较为保守。与同处欧洲的英国株CAV序列相比 ,序列较为一致。本研究对所克隆的调亡素编码蛋白进行了疏水性分析和抗原表位优势分析。

水稻条纹病毒云南分离物CP基因克隆及序列比较分析

对采自云南保山、楚雄、石林和宜良等4地的水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA,经RT-PCR扩增,获得4个RSV云南分离物的CP基因片段。序列测定表明,该片段长999 bp,其中CP基因由969个核苷酸组成,编码322个氨基酸。与其它已报道的RSV分离物CP基因进行同源性比较,发现我国RSV分离物可以划分为2个不同的组,大部分RSV云南分离物为一组,其它的RSV分离物为另一组。以RSV-CX i分离物的CP与纤细病毒属的其它5种病毒的CP进行氨基酸同源性比较,结果表明RSV与MStV亲缘关系最近,而与RGSV亲缘关系最远。

我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较

以相当于 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)原型株 HPRS- 10 3基因组碱基 #5 394～ #5 416及 #7811～ #7794的 1对引物做 PCR,在 2 0 0 0～ 2 0 0 1年从山东、河南和宁夏分离的 8株 AL V- J中 ,有 6株可以扩增出含 gp85基因的 2 .2 kb左右的特异性片段。对其中 5株的扩增片段做了序列分析 ,结果表明 ,这 5个毒株的囊膜糖蛋白 gp85与原型株 HPRS-10 3有 93.4%～ 96 .8%的同源性 ,与我国最早的分离株 SD990 2有 93.7%～ 98.7%的同源性 ,它们相互之间的同源性为 91.2 %～ 98.7%。由此说明 ,我国 AL V- J的 gp85基因正在不断发生变异。

猪肺炎支原体表面蛋白P46基因的克隆与序列比较

猪肺炎支原体 (MycoplasmaHyopneumoniae ,Mhp)兔化弱毒株R6 5 9株、济南强毒株、强毒Z株、国际标准株2 32 ,通过A2 6培养基培养 ,提取DNA ;利用PCR技术从四株猪肺炎支原体中均能扩增出目的条带。将该序列克隆到pGEM_T_Easy载体上测序。结果表明 ,克隆序列全长 115 2bp ,编码 383个氨基酸和一个终止子 (TAA) ;该序列中含有 3个TGA编码Trp ,而不是终止密码子。比较兔化弱毒株与济南强毒株、国际标准株 2 32及NCBI上发布的J株的P4 6基因序列 ,发现它们的同源性分别为 98 6 %、99 2 %、99 2 % ;比较它们编码的氨基酸发现它们的同源性分别为 98 7%、99 2 %、99 2 %。结果表明猪肺炎支原体的P4 6基因在猪肺炎支原体种内是很保守的 ,因此建立以P4 6蛋白为诊断抗原的ELISA具有潜在的意义。

基于有向图的活动序列比较及其在装配序列评判中的应用

在分析活动序列内涵的基础上,提出了用于描述活动序列及评价指标参考序列的两个模型———完全AOV网和扩展AOV网,给出了一种基于有向图的活动序列相似度的计算方法,实现了工程任务安排决策中活动序列方案对各评价指标满足程度的量化计算。在装配序列规划中的应用实例表明,该方法较好地解决了工程任务安排决策中方案的自动评价与选择问题。

不同抗冷性水稻中编码甘油-3-磷酸转酰酶的部分cDNA的序列比较研究

采用RT -PCR技术 ,以根据国外报道的几种双子叶植物的甘油 - 3-磷酸转酰酶的相对保守的氨基酸序列而设计的简并引物作为扩增引物 ,从不同抗冷性水稻品种中均扩增到一段约 315bp的cDNA片段。测序结果表明它们都是编码GPAT的部分cDNA ,含有 315个核苷酸 ,编码 10 5个氨基酸。比较它们之间的核苷酸及推导氨基酸序列 ,发现有一定差异 ,且抗冷性相差越大的品种间差异越大。抗冷性的差异可能与脯氨酸的替换有关。