深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤氏酵母SMD1168中表达的研究

引物根据△6-脂肪酸脱氢酶（D6D）基因以及酵母蛋白表达载体pGAPZctA的多克隆位点进行引物设计，并在上游插入ECoRI位点、下游插入XhoI位点，从深黄被孢霉中克隆D6D基因，构建pMD18-T-D6D载体与pGAPZtxA—D6D载体。将重组质粒线性化，并将其电转导入到毕赤氏酵母（PichiapastorisSMD1168）中，Zeocin抗生素筛选高拷贝转化子，对重组菌进行诱导表达。经过Tricine—SDS—PAGE分析和蛋白质免疫印迹（Westernbloting）试验，证明△6-脂肪酸脱氢酶融合蛋白具有免疫学活性。结果成功构建了重组酵母pGAPZdA—SMD1168，为利用基因工程菌生产y-亚麻酸（GLA）奠定理论基础。

毕赤氏酵母SMD1168/HuIFNα-2b分泌型表达的研究

利用毕赤氏酵母SMD1168构建huIFNα 2b分泌型高效表达工程菌株 ,以提高huIFNα 2b表达量和生物比活性 ,增强临床治疗效果和降低临床应用的毒性副作用。将克隆修饰的huIFNα 2b基因插入pGAPZα A之GAP启动子下游位点 ,构建成含α factor信号肽的重组表达载体 ,转入毕赤氏酵母 (Pichiapastoris)SMD1168,构建成分泌型表达huIFNα 2b的酵母工程菌株。SDS PAGE分析表明 ,该工程菌株huIFNα 2b表达量占菌体分泌总量的 50 %以上 ,表达量为 10 0～ 12 0 μg ml;MTT法测定纯化样品的生物比活性为 6 69× 10 8IU mg蛋白～ 1 11× 10 9IU mg蛋白 ,并通过柱层析分离纯化了huIFNα 2b ,纯度达 99 7% ,回收率达 15%～ 2 0 % ;Westernblotting分析表明表达的huIFNα 2b具有与天然huIFNα

巴氏毕赤酵母SMD1168表达人溶菌酶的发酵条件

研究用毕赤酵母SMD1168菌株(MutS,HIS4+)表达人溶菌酶(HLZ)的发酵条件。此菌株具有对胞外分泌的外源蛋白不降解、对反应器氧传递效率的限制不敏感的特性,有利于在常规反应器条件下的过程放大。在培养基中添加复合维生素,在流加甲醇溶液中添加山梨醇或甘露醇可维持细胞正常的生长和代谢,并表达高活性的HLZ。采用恒溶解氧的方式流加甘油溶液以提高细胞密度,在一段时间内使细胞处于碳源半饥饿状态后,使用恒速流加甲醇溶液诱导HLZ表达。HLZ的体积生成速率达到9.6mg/(L·h)左右,上清液中HLZ的含量约为1.6g/L,发酵周期为110h。

黑曲霉酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以黑曲霉Aspergillus niger基因组DNA为模板,PCR扩增出酸性α-淀粉酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,重组质粒pPIC9K-asAA转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,酸性α-淀粉酶大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,2%甲醇诱导培养168h后酶活力达到最大值2838U/mL。SDS-PAGE结果显示该重组酶的分子质量为58kD。该酶的最适反应pH值为4.0,在pH3.0～6.0之间酶活力基本保持稳定,最适反应温度为70℃,在工业生产常用温度50℃条件下,该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。重组毕赤酵母遗传稳定性良好。

HPV16(新疆株)E6在Pichia pastoris酵母中的分泌表达

目的 :利用酵母Pichiapastoris真核蛋白表在系统 ,表达HPV16 (新疆株 )E6 (HPV16XJE6 )蛋白。方法 :根据HPV16XJE6基因序列设计引物 ,并分别在 5′引物和 3′引物中引入了EcoRI和XbaI酶切位点 ,经PCR扩增后与pMD18-T载体相连 ,再将HPV16XJE6从T载体上切下并克隆至穿梭质粒pGAPZαA上 ,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA -E6经线性化后 ,采用LiCl法将重组穿梭质粒转入酵母细胞内 ,Zeocin+筛选鉴定 ,经小瓶发酵后 ,取上清作SDSPAGE检测。结果 :HPV16XJE6成功地在酵母真核表达系统获得表达 ,表达产物的分子量为 2 0kD ,为深入研究HPV16XJE6蛋白功能奠定了理论基础。

普鲁兰酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

以普鲁兰酶生产真菌YBJ10-2基因组DNA为模板,PCR扩增出普鲁兰酶的结构基因,将此基因插入载体pPIC9K,构成重组质粒pPIC9K-Pullulanase,转化毕赤酵母SMD1168,并通过G418平板培养基筛选高拷贝转化子,普鲁兰酶表达并分泌到胞外。该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,摇瓶培养中,当甲醇达到最佳诱导浓度3%,酶的最高表达量可达225U/mL。该酶能够长时间保持稳定,并具有较高的酶活力。重组毕赤酵母遗传稳定性良好。

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在毕赤酵母中的融合表达及其活性研究

为了获得结核分枝杆菌ESAT 6蛋白在毕赤氏酵母中的高效表达 ,将人α 2a干扰素基因、结核分枝杆菌esat 6基因经PCR扩增并加上相应的酶切位点 ,两基因之间的DNA接头编码肠激酶识别的多肽 ,DNA经酶切连接插入分泌型载体pPIC9K ,将重组表达质粒pPIC9K α2a esat6用SalⅠ单酶切之后 ,电击转入PichiapastorisSMD116 8中 ,采用G4 18梯度筛选获得高抗性转化子。以甲醇作为诱导物 ,发酵 4d后取上清 ,进行SDS PAGE和Westernblot鉴定并分析表达产物的干扰素活性。结果表明 ,重组菌株成功地分泌表达了分子量大小约为 30kD的融合蛋白 ,表达产物不仅具有较高的干扰素活性 ,而且可以和结核病人血清发生特异性结合 。

重组人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达的研究

目的构建含有人组织因子(h TF)基因的毕赤酵母高效表达系统,实现胞外高效分泌表达。方法全基因合成h TF胞外区序列,PCR扩增该基因片段,经Xho I和Xba I双酶切后,和表达载体p GAPZa A相连,并电转化毕赤酵母SMD1168H。在YPD培养基中进行表达,取培养基上清进行SDS-PAGE检测,并利用Western进行确证,通过BCA法检测胞外蛋白表达量。结果在毕赤酵母中成功表达人组织因子,通过Western确证目的蛋白分子量大小正确,BCA法检测摇瓶表达胞外总蛋白达1 g/L,Bandscan软件分析目的蛋白占胞外总蛋白80%以上。结论本研究实现了截短型人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达,获得了具有与完整因子相同凝血活性的截短型组织因子。