牛流行热病毒糖蛋白G_1抗原表位在毕赤酵母中的表达和抗原性鉴定

从包含牛流行热病毒G蛋白基因的质粒pMD-G中克隆G1抗原表位区基因,亚克隆进表达载体pPIC9K,构建重组载体pPIC9K-G1,线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418压力和PCR法筛选阳性重组酵母进行诱导表达。经SDS-PAGE、脱糖基化分析、Western blot、ELISA、兔体免疫实验和特异性分析,表明该基因在GS115中表达并进行了适度的糖基化,表达蛋白有良好的生物学活性和特异性,可作为包被抗原,开发ELISA诊断试剂盒。

毕赤酵母G5拮抗葡萄灰霉病机理初探

针对新疆红提葡萄中分离的生防菌株——毕赤酵母G5,以葡萄灰霉菌(Botrytis cinerea)为靶标菌,研究了G5对葡萄灰霉菌孢子及对葡萄果实内5种关键酶活性的影响,初步探讨了G5拮抗葡萄采后灰霉病的机理。采用离体(in vitro)实验与活体(in vivo)实验的方法对毕赤酵母菌G5拮抗葡萄灰霉病的机理进行探究。结果发现,毕赤酵母菌株G5对葡萄灰霉菌孢子的萌发和菌丝生长均有抑制作用,对灰霉菌丝的抑制率最高为80.20%,对灰霉孢子抑制率达86.89%;两者间存在营养竞争关系,有重寄生现象产生,拮抗菌自身并不分泌抗菌物质。此外,该菌株能诱导果实体内过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶的酶活性,使其酶活性有显著提高,说明毕赤酵母G5可以有效的诱导果实内抗病相关酶的活性,增强对灰霉病的抑制效果。毕赤酵母G5拮抗葡萄灰霉病的机理主要包括营养竞争、诱导抗病性,是否有重寄生作用还需要进一步验证。

鲤鱼g型溶菌酶基因的cDNA克隆及其在毕赤酵母中的表达

从鲤鱼鳃组织中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG).该基因的全长cDNA为558 bp,除去终止密码子,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征.通过PCR方法在CLYG基因的5'和3'端分别引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点.扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYG后,电转至毕赤酵母X-33,筛选得到的阳性转化子在1.0%甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导表达72 h,获得重组体CLYG.SDS-PAGE和蛋白质印迹分析显示,在毕赤酵母中成功表达了重组体CLYG.

HSV-1 stocker株糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体的构建及序列分析

目的构建Ⅰ型单纯疱疹病毒型特异性包膜糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体,并进行序列分析。方法PCR扩增HSV-1-gG基因的膜外区,克隆于pGEM-T载体,转化DH5α,提取质粒酶切鉴定后,与pPIC9K载体连接,转化DH5α,筛选阳性克隆,鉴定后转化GS115菌,构建酵母表达载体。对克隆的序列进行分析,预测表达产物的理化特性、抗原性及表达形式。结果获得的重组酵母表达载体pPIC9K-gG,测序结果证实为HSV-1-gG基因,序列分析其高度保守,预测蛋白相对分子质量15870,等电点pI为4.72,包含全部膜外区分值达1.7的6个强抗原决定簇,将以可溶性形式分泌表达于胞外。结论已成功构建HSV-1stocker株糖蛋白G基因膜外区毕赤酵母表达载体。

德国小蠊主要变应原Bla g 2在毕赤酵母菌中的表达

目的在毕赤酵母菌(Pichia pastoris)中表达德国小蠊主要变应原Blag2,以获得其可溶性蛋白。方法根据已知的Bla g 2基因序列设计带有酶切位点的引物。PCR扩增德国小蠊变应原Blag2基因,经酶切后将该基因连接到毕赤酵母真核表达载体pGAPZaA,获重组质粒pGAPZaA-Blag2,该重组质粒线性化后,经电转化法转化毕赤酵母GS115,用PCR筛选出重组子并在YPD培养基中表达。用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白Bla g2,用蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫学活性。结果重组质粒pGAPZaA-Blag2转化毕赤酵母GS115后进行表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)分析显示,重组蛋白Blag2表达产物以可溶性分子形式存在,相对分子质量(Mr)为45 000。培养3 d的表达量占上清总蛋白的50％。表达产物重组蛋白Blag2经Ni2+亲和层析纯化后,Western blotting分析,在约Mr 45 000处有1条明最的特异性条带,该蛋白具有免疫学活性。结论获得了真核表达的德国小蠊主要变应原重组蛋白Blag2,该蛋白以可溶性蛋白的形式分泌到培养液中,避免了原核表达的变复性过程。

汉坦病毒囊膜糖蛋白G2在毕赤酵母GS115中的表达及鉴定

构建了编码汉坦病毒囊膜糖蛋白G2基因的重组质粒,在毕赤酵母中表达,为汉坦病毒基因工程疫苗的研究提供实验基础。利用PCR法从含汉滩病毒76-118株M基因的M56质粒中扩增编码糖蛋白G2的基因片段,克隆入酵母分泌表达载体pPICZαA,构建重组质粒pPICZαA-G2。酶切鉴定挑取的阳性克隆,转化入GS115工程菌,在含100μg/mLZeocin的YPD培养基上筛选。挑选单菌落,PCR鉴定阳性克隆,用0.5%甲醇诱导表达,并利用SDS-PAGE及Western-Blot鉴定表达产物。序列分析表明所获得的基因片段与编码汉滩病毒76-118株囊膜糖蛋白G2的基因一致;100μg/mLZeocinYPD培养基上筛选出含pPICZαA-G2转化子,PCR鉴定为阳性克隆;SDS-PAGE可见约70kDa处有目的蛋白表达条带,经Western-Blot证实该条带为汉滩病毒囊膜糖蛋白G2。成功地构建了重组酵母表达载体pPICZαA-G2,并在毕赤酵母中初步表达成功,为今后汉坦病毒囊膜糖蛋白G2表达纯化以及基因工程疫苗的制备奠定了一定基础。

鼠层粘蛋白α5链G结构域E3和E8基因在毕赤酵母中的表达

为探索层粘连蛋白G结构域在甲醇型酵母(Pichia Yeast)中的表达,用PCR的方法获得了鼠层粘蛋白α5链G结构域的E3(LG4-5)和E8(LG1-3)基因片段,并将其克隆到P.pastoris分泌型表达载体pPIC9中,构建了pPIC9-E3和pPIC9-E8等2个毕赤酵母重组质粒。将测序正确的质粒用电转化的方法转化酵母表达受体菌GS115,通过表型和PCR的方法筛选出P.pastoris重组子。用甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果表明,鼠层粘蛋白α5链G结构域的E3和E8片段在毕赤酵母中获得了成功的表达。

汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

目的 研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法 采用RT PCR扩增G2基因 ,转化感受态大肠杆菌DH5α,DNA序列分析后 ,SnaBI、NotI两次酶切下G2 ,再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上 ,构建表达载体 pPIC9K G2 ,SalI线形化后电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115 ,G418筛选转化子 ,1%甲醇诱导、摇瓶培养。结果 序列分析表明 ,克隆序列与设计相符 ,12 %SDS PAGE显示重组蛋白为5 0KD ,Western Blot证实其生物学活性。

重组毕赤酵母发酵产PGA的条件优化

对重组毕赤酵母发酵产青霉素G酰化酶(PGA)的培养条件进行探讨。依据基础盐摇瓶发酵培养基,通过单因素试验考察了接种量、甘油浓度、pH以及诱导过程中氨水浓度、甲醇浓度等因素对PGA表达的影响。并采用Box-Behnken实验设计进行因素组合优化。结果与意义:最佳发酵条件为:甘油浓度40 g/L、氨水浓度0.1%、甲醇浓度1.0%、pH 5.6、接种量10%,在此条件下PGA酶活力达到8 680±12 U/L。本实验结果对下一步利用发酵罐进行重组毕赤酵母扩大培养有借鉴作用。

甲壳素亲和层析在人g2型溶菌酶制备中的应用

目的制备甲壳素亲和纯化介质,设计有效的纯化技术路线,对毕赤酵母表达的人g2型溶菌酶(human goose-type lysozyme 2,HLys G2)重组蛋白进行纯化。方法研究碱化、稀酸处理、碱化时间、碱浓度等各种因素对甲壳素介质性能的影响;对重组毕赤酵母进行甲醇诱导表达,依次采用亲和层析、阴离子交换层析、透析等方法从发酵液上清中纯化HLys G2,对最终纯化产物的纯度使用HPLC进行测定,杀菌活性使用双层琼脂平板扩散法进行测定。结果经处理后,在常压下甲壳素亲和介质洗脱速度可达4.5 ml/(min·cm2),对HLys G2吸附容量为1.8 mg/ml,总活性的收率为76.5%,得到的HLys G2纯度>99.0%,对溶壁微球菌具有杀灭活性。结论制备的甲壳素亲和介质具有良好性能,以甲壳素亲和层析为中心的纯化方法可有效纯化HLys G2,为规模化制备HLys G2奠定了基础。

人g2型溶菌酶的多克隆抗体制备及其在睾丸中的表达分析

目的以真核表达的人g2型溶菌酶(human goose-type lysozyme 2,LysG2)为免疫原制备抗LysG2的兔多克隆抗体,检测LysG2在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供线索。方法对LysG2毕赤酵母GS115转化菌株进行高密度培养,甲醇诱导目的蛋白表达并通过甲壳素亲和色谱纯化,以重组蛋白为免疫原制备兔抗LysG2多克隆抗体。通过ELISA检测抗体效价后,对人体各组织、精子及精液标本进行Western印迹分析,并对人睾丸组织进行免疫组化检测。结果以毕赤酵母表达LysG2为免疫原制备的抗体具有高效价,表达谱分析表明LysG2在睾丸中有表达,在精子蛋白提取物中没有检测到其存在,在精浆中检测到了LysG2。免疫组化检测结果显示LysG2在睾丸中主要定位于间质组织的Sertoli细胞。结论本研究成功以真核表达的LysG2制备了该蛋白多克隆抗体,LysG2在睾丸Sertoli细胞有表达,并分泌到精浆中,提示LysG2可能在男性生殖系统先天性免疫中发挥作用。

来源于瓶霉Phialophora sp. G5的酸性木聚糖酶基因的克隆及性质的研究

通过简并PCR和TAIL-PCR技术从瓶霉Phialophora sp. G5菌株基因组DNA中克隆得到一个新的编码b-1,4-木聚糖酶的基因,命名为xyn11G5。该基因ORF全长879 bp,共编码292个氨基酸和一个终止密码子,前19个氨基酸为信号肽序列。将xyn11G5在毕赤酵母中进行分泌表达,重组蛋白经纯化达到电泳纯。酶学性质分析表明,该重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为5.0,在中性条件下具有良好的稳定性,并且具有一定的热稳定性,在饲料行业和生物能源行业领域具有潜在的应用前景。

重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵动力学研究

构建了重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵动力学模型。实验考察了分批发酵过程中甘油消耗、甲醇浓度、菌体浓度、溶氧、补料时间对青霉素G酰化酶活力的影响。应用Matlab软件,对菌体生长、基质消耗和产物生成方程进行最优参数估算和非线性拟合,得到相应的动力学模型。模型的计算值与实验值能较好地拟合,表明所建模型能较好反映重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵过程。

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。

汉坦病毒G1糖蛋白毕赤酵母表达系统的构建

目的构建汉坦病毒HTN型和SEO型G1糖蛋白的毕赤酵母表达系统。方法应用RT-PCR法扩增汉坦病毒Z10株和L99株编码G1包膜糖蛋白的基因,将扩增产物分别与pMD18-T simple载体连接,经序列分析后双酶切,定向克隆入载体pPICZαA,继而用BstX I酶切线性化重组质粒并电转化入P.pastoris X33感受态细胞,用Zeocin筛选转化子进行鉴定。结果 PCR扩增产物Z10株为1 937bp、L99株为1 991bp,与T载体相连测序结果与GenBank相应序列比较,核苷酸序列同源性分别为99.5%和99.7%,其编码蛋白质二级结构均无改变。定向克隆毕赤酵母表达载体获得pPICZαA-Z10G1和pPICZαA-L99G1,分别电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株PpX33-Z10G1和PpX33-L99G1,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符。结论成功构建汉坦病毒HTN型和SEO型G1糖蛋白毕赤酵母表达系统,为进一步研究奠定基础。

单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gG在毕赤酵母表达系统中的表达及抗原性分析

目的 构建单纯疱疹病毒gGl-毕赤酵母表达系统并初步分析表达产物的抗原活性.方法 以HSVI病毒增殖物为模版,用PCR扩增HSV-1gGl基因全序列,将目的序列插入载体pPIC9K,测序后电转化GS115菌株进行G418筛选、甲醇诱导表达,用SDS-PAGE方法跟踪分析表达条件,用ELISA方法检测目的蛋白的抗原活性.结果 DNA测序、凝胶电泳、ELISA试验结果表明pPIC9K-HSVgGI载体构建成功,G418压力筛选得到的重组酵母菌株可分泌表达目的蛋白gGl,蛋白可与特异性抗体发生结合反应.结论 构建了HSV一1 gGl酵母表达系统,表达的目的蛋白gGl具有抗原活性.

人sCR1转化克隆菌的快速筛选和鉴定

目的用G418快速筛选及鉴定重组人可溶性补体受体1型(sCR1)高拷贝转化克隆菌。方法采用的sCR1重组质粒,经电转化将其克隆入酵母SMD1168细胞株中,利用G418的抗性,快速筛选转化克隆菌,并对克隆菌株提取基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)鉴定;该克隆菌经甲醇诱导培养后,对其表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot鉴定分析。结果从G418快速筛选的毕赤酵母克隆菌株中提取的基因组DNA进行PCR鉴定,获得了高拷贝整合的重组毕赤酵母克隆菌株,经诱导培养后,对其表达产物进行SDS-PAGE及Western blot鉴定分析,该表达蛋白在SDS-PAGE上表现为相对分子质量大于30 000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别,成功获得高拷贝整合的重组毕赤酵母细胞株,可表达出重组人sCR1融合蛋白。结论经高浓度G418药物快速筛选的高拷贝毕赤酵母SMD1168细胞株,用于表达人sCR1融合蛋白。

毕赤酵母己糖运载体HXT1基因缺失菌株的构建

葡萄糖在酵母胞内的转运是依靠己糖运载体家族成员完成的。目前在酿酒酵母中已鉴定了18个己糖运载体基因,各自功能也已得到深入的研究。然而在作为优良蛋白表达系统的毕赤酵母中,目前国内外尚未有此类基因的相关报道。本文基于酵母同源重组率高的特性,以G418作为抗性筛选标记,分别在其5′和3′端连接待缺失毕赤酵母基因HXT1开放阅读框ORF的上下游各200bp作为同源重组区,电转毕赤酵母GS115感受态,通过不同浓度G418抗性平板筛选,最终得到了HXT1基因缺失的毕赤酵母菌株GS115ΔHXT1。通过与野生株比较发现,HXT1基因缺失株的生长状况及葡萄糖利用都有所下降。

重组猪胰蛋白酶及其R122位点突变体在毕赤酵母中的高效表达及其性质研究

目的：研究R122位点突变重组猪胰蛋白酶,与野生型酶相比较,该位点对重组猪胰蛋白酶（RPT）性质的影响。方法：以毕赤酵母GS115作为表达宿主,对RPT、突变体mRPT（R122H）和mRPT（R122H/R73G/R130T）进行表达及纯化。并对其性质和稳定进行对比研究。结果：重组胰蛋白酶及其突变体在毕赤酵母中均获得了高效表达。相对于RPT,突变体mRPT（R122H）和mRPT（R122H/R73G/R130T）在以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）为底物时,具有更强底物结合力,三者的米氏常数分别为18.8μmol/L、9.0μmol/L和11.0μmol/L;两突变体耐高温耐碱能力增强;在Ca2＋存在及去除的条件下,突变体具有更强的抗自降解能力。结论：可以利用毕赤酵母高效表达重组胰蛋白酶及其突变体。mRPT（R122H）和mRPT（R122H/R73G/R130T）相对于野生型RPT,对高p H条件和高温的耐受性增强,该稳定性的提高主要归因于R122位点的突变。