巴斯德毕赤酵母GS115基因组研究进展

毕赤酵母生物表达系统已成功地表达了多种重组外源活性蛋白,广泛地被应用于能源、医疗、科学研究等方面的研究。综述了2008年以来毕赤酵母GS115基因组研究,以期从分子水平解释转录调控、表达调控及翻译后修饰等机理,进而解决毕赤酵母发酵过程中产量低、过糖基化等瓶颈。

嗜热菌Geobacillus Kaustophilus HTA426磷酸三酯酶在毕赤酵母GS115中的表达

将嗜热菌Geobacillus Kaustophilus HTA426中的磷酸三酯酶基因转入毕赤酵母GS115中,整合到染色体DNA基因组上,并进行诱导表达.SDS-PAGE和Western-blot试验结果显示,重组蛋白是一个分子量约为50KD的磷酸三酯酶二聚体.酶活检测证明重组蛋白具有较高的磷酸三酯酶活性,其最适温度为70℃,最适pH为10.0.

汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

目的 研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法 采用RT PCR扩增G2基因 ,转化感受态大肠杆菌DH5α,DNA序列分析后 ,SnaBI、NotI两次酶切下G2 ,再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上 ,构建表达载体 pPIC9K G2 ,SalI线形化后电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115 ,G418筛选转化子 ,1%甲醇诱导、摇瓶培养。结果 序列分析表明 ,克隆序列与设计相符 ,12 %SDS PAGE显示重组蛋白为5 0KD ,Western Blot证实其生物学活性。

酸性植酸酶phyB在毕赤酵母GS115中的表达

通过PCR方法扩增得到无信号肽无内含子的酸性植酸酶phyB基因,将此基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并转化毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组毕赤酵母.在甲醇的诱导下,该植酸酶phyB基因在毕赤酵母中得到表达.经SDS-PAGE凝胶电泳分析,该重组蛋白的相对分子质量为7.5×104,而该植酸酶在大肠杆菌DH5α表达系统中表达的相对分子质量为6.0×104,这可能是由于糖基化的结果.酶学性质检测发现,表达的植酸酶最适作用温度为65℃,比野生原始菌株的提高了10℃;诱导pH值为5.5时,蛋白的表达量最高,为10 528.6 U/mL,是野生菌株的2.8倍;最适作用pH值为2.5;在70℃条件下处理60 min,该酶的相对酶活力为40%,在75℃时处理10 min,该酶的相对酶活力为10%.

毕赤酵母GS115中N-乙酰转移酶在大肠杆菌中的克隆表达与性质研究

为了研究P.pastoris Mpr1的生理特性,在E.coli JM109胞内中成功表达来源于P.pastoris GS115的Mpr1酶,并利用响应面分析法对诱导温度、IPTG诱导浓度、起始诱导OD进行发酵优化,酶活达到(610.3±9.5)m U/m L。酶学性质显示,Mpr1酶的最适反应p H范围为7.0-7.5,最适反应温度是30℃。通过分析重组表达Mpr1菌株和对照菌株的培养过程,显示重组菌株的生长能力显著增强,原因是Mpr1降低了细胞内的ROS水平。

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2在毕赤酵母中的高效表达

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xyn ZF-2（成熟肽碱基）插入表达载体p PIC9K中,SalⅠ线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经MD平板、G418梯度和摇瓶复筛筛选出多克隆阳性转化子。选择28h的种子,每隔24h补加1.5%的甲醇,发酵96h后,比酶活可达13210U/mg;SDS-PAGE分析表明,该蛋白相对分子质量为23.0ku;重组酶最适作用温度为45℃,最适作用p H为5.0,在温度35--40℃、p H5--7条件下有良好的稳定性,Ca2＋对酶的激活作用最明显。

合成嗜热酸性淀粉酶的毕赤酵母表达

把密码子优化后的超耐热酸性α-淀粉酶的基因BD5088,引入载体pPIC9K中,将正确构建的重组质粒pPIC9K-BD5088转化毕赤酵母GS115细胞,得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,重组超耐热酸性α-淀粉酶PrBD5088在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外。该酶受甲醇的严格调控和诱导,在诱导培养5 d后酶活力达到最大值,表达量可达到约200 mg/L。与原核表达产物ErBD5088相比,PrBD5088的酶学性质发生了一定的改变。其最适反应温度由80℃增加到90℃。最适反应pH值仍为pH5.6,但范围更宽,在pH值5.0～6.5之间,其相对酶活在90%以上,在pH4.0～8.0范围内酶活性保留50%以上。而ErBD5088则只在pH5.0～7.0范围内能维持活性的50%以上。且PrBD5088的温度稳定性远高于ErBD5088。PrBD5088在100℃条件下热处理1 h仍具有80%以上的酶活力,而ErBD5088相同条件下的半衰期只有20 min。此外,Ca2+和Zn2+对维持rBD5088活性和稳定性会产生轻微促进作用,该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。SDS-PAGE测得该酶的分子量为56 ku,高于原核表达的酶蛋白。重组α-淀粉酶PrBD5088不存在N-连接的糖基化,但是存在O-连接的糖基化现象。本实验结果表明O-连接糖基化可适当提高PrBD5088的热稳定性、最适温度和酸性pH条件下酶活性。

毕赤酵母表达皮蝇素A蛋白

建立了用毕赤酵母表达系统表达皮蝇素A（Hypodermotin A，HA）的技术，并对表达条件进行了优化筛选。将皮蝇素A基因连接到质粒pPIC9k上，构建了重组转移质粒pPIC9k—HA。重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115后，用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选。重组酵母细胞在含0．5％甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白，培养3d后收取上清，用阴离子交换层析柱分离纯化。经SDS—PAGE检测，所表达的蛋白相对分子质量约为30000。Western—blotting表明，该蛋白能与兔抗HA血清特异性结合。明胶电泳检测显示，该蛋白具有酶活性。单因素改变表达条件的结果表明，甲醇浓度在0．5％～1％、溶氧量在70％以上、诱导2～3d的情况下表达产量最高，达1500mg／L左右。该研究结果对防治牛皮蝇蛆痛疫苗的深入研究及毕赤酵母在寄生虫领域的应用有一定价值。

构建人Cu,Zn-SOD毕赤酵母转化子及其高表达研究

设计人Cu,Zn-SOD酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的人Cu,Zn-SOD基因真核表达载体,通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得的重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,基因拷贝数提高2～8倍,活性检测显示提高2～4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,其分子质量为40kD左右,低糖基化,均为分泌表达。Western blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定;Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0、30℃、体积分数1.5%甲醇诱导72h测得上清的目的蛋白表达最好,表明构建了高表达菌株。

重组水貂生长激素真核表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

【目的】构建水貂生长激素(mGH)基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得水貂生长激素奠定基础。【方法】将体外合成的水貂生长激素基因插入分泌型表达载体pPIC9K。将重组的pPIC9K-mGH用SacI酶切后,LiC1法转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115,经G418筛选后进行甲醇诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blot检测酵母上清中水貂生长激素的表达。【结果】酵母上清中可见与目的蛋白相对分子量(31kd)相符的条带,该条带可被水貂生长激素多克隆抗体特异识别。【结论】正确构建了水貂生长激素真核表达载体,该蛋白能在巴斯德毕赤酵母中成功表达。

不同毕赤酵母表达的黑曲霉NRRL3135植酸酶A的性质的比较

黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135植酸酶A(PhyA)是一种动物饲料添加剂,其能够水解植物饲料中的植酸,释放无机磷,降低动物粪便中的有机磷对环境的污染.但饲料制粒中需要一个加热的过程,造成了植酸酶活性的大量丢失.用质粒pPICZaA作为的载体分别在毕赤酵母GS115、X33和KM71中表达PhyA基因,然后用DEAE-fast flow阴离子交换色谱柱对三个重组酶进行纯化,并比较它们的性质.结果发现从毕赤酵母GS115中获得的重组酶在80 C加热20 min后,仍然保留原始活性(91.2±3.14)%,高于用毕赤酵母X33和KM71作为表达宿主的结果,并且其热稳定性远远高于所有先前报道的重组PhyA以及野生型的PhyA.

人血管抑素K1-3在毕赤酵母胞内表达的研究

目的:构建人血管抑素K1-3的重组酵母胞内表达质粒PH IL-D2/K1-3,获得重组目的蛋白。方法:从胎儿肝脏组织用RT-PCR方法扩增人血管抑素K1-3目的基因,克隆至酵母胞内表达质粒PH IL-D2中,线性化后转化到毕赤酵母GS115胞内,经PCR和Sourthern杂交筛选出阳性转化子,并用甲醇诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE(12%)和W estern b lot检测,经赖氨酸亲和层析柱纯化后,用Lowry法测定蛋白含量,并进行生物活性测定。结果:SDS-PAGE和W estern b lot结果显示,表达蛋白质的相对分子量为30kd左右,低糖基化。Lowry法测定蛋白表达量为6.8mg/L。活性测定实验表明重组血管抑素能特异抑制人血管内皮细胞的增殖。结论:在毕赤酵母GS115胞内成功表达了人血管抑素K1-3重组蛋白。

ECM830电穿孔仪在毕赤酵母电转化中的应用

用线性化质粒与酵母细胞混合后进行电转化,培养细胞,菌体计数,通过计算转化率探索ECM 830电转仪的转化条件,确定出毕赤酵母电转化最佳条件,低电压模式;电压300 V;脉冲长度15 ms;脉冲次数为1次;为ECM 830电转仪在酵母转化中的应用提供依据。

甜蛋白Brazzein在毕赤酵母中的表达及应用

巴西甜蛋白(Brazzein)是分离自非洲西部野生植物Pentadiplandra brazzeana Baillon果实中的一种天然高倍甜味蛋白,具有较好的食品应用潜力.利用毕赤酵母GS115对巴西甜蛋白及蛋白二硫键异构酶(protein di-sulfide isomerase,PDI)进行共表达,重组Brazzein在发酵液中分泌表达量为1 g/L.采用超滤-纳滤膜分离系统和冷冻干燥技术开发重组Brazzein的低成本制备工艺,并完成口感评价,甜度倍数为蔗糖的40倍.同时研究了重组Brazzein对常见致病菌和肠道益生菌的体外抑菌性能,结果表明,重组Brazzein对白念珠菌的最低抑菌质量浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为15 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的MIC值为7.5 mg/mL,对桧状青霉的MIC值为3.75 mg/mL,对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌没有发现明显的抑菌效果.该研究为Brazzein在甜味剂方面的推广应用提供了理论研究基础.

巴斯德毕赤酵母鼠李糖代谢基因LRA3功能及其启动子顺式作用元件的研究

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)由于具有遗传操作简单、重组蛋白高效分泌、高密度发酵和翻译后修饰等优点,常被用作表达宿主。其中基于甲醇诱导型强启动子P AOX 1的毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的表达系统,但该系统需使用易燃易爆有毒的甲醇作为诱导剂,极大地限制了其在食品酶和医药重组蛋白生产领域的应用,因而,开发无毒物质诱导的表达系统具有重要意义。前期研究预测了毕赤酵母鼠李糖代谢途径相关基因LRA 1~LRA 4,其中LRA 3启动子P LRA 3可实现重组蛋白在毕赤酵母中的高效表达,但其在调控重组蛋白表达效果以及转录严谨性方面仍需进一步改进。基于此,通过敲除和回补实验证实了LRA 3参与毕赤酵母鼠李糖代谢途径,并采用方便易行的环化RNA反转录PCR(circularized RNA reverse transcription polymerase chain reaction,CRRT-PCR)确定了P LRA 3的转录起始位点,预测了与转录密切相关的元件。研究结果为后期启动子的理性改造提供了理论依据。

基于重组毕赤酵母的2-癸烯酸生物合成研究

2-癸烯酸是一种具有2位不饱和键的中链脂肪酸,是合成功能化合物10-羟基-2-癸烯酸的重要前体物质。本研究首先将硫脂酶基因YdiI和脂肪酸CoA脱氢酶基因FadA分别连接至具有pGAP启动子的pGAPZαA载体上,并电转化至毕赤酵母GS115感受态中,经过Zeocin抗性筛选及基因组PCR鉴定后,成功获得重组载体同源重组至毕赤酵母GS115基因组上的阳性重组子。采用气相色谱-质谱联用方法对发酵产物进行检测,结果发现培养12 h后发酵产物中有2-癸烯酸出现,在发酵24 h产量可达33.7 mg/L,这表明YdiI和FadA基因已成功转入毕赤酵母GS115中。本研究成功构建了能够合成2-癸烯酸的重组毕赤酵母GS115工程菌,为下一步利用毕赤酵母进一步合成10-羟基-2-癸烯酸打下基础。

重组α-1,3-葡萄糖苷酶的毕赤酵母表达及发酵优化

Acremonium sp.S4G13来源的α-葡萄糖苷酶基因连接到p PIC9K载体上并在Pichia pastoris GS115中表达。在此基础上对重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-AGL产重组α-葡萄糖苷酶的发酵条件进行了单因素优化试验,结果表明最优条件为:生长阶段接种量10%,甘油体积浓度3%,初始pH 6.0;诱导阶段甲醇初始添加量1%,甲醇补加量0.5%,装液量10%,诱导温度25°C,山梨醇添加量6 g/L。在最优条件下发酵120 h,酶活可达7.8 U/mL,相比优化前酶活1.22 U/mL提升了5.4倍。

启动子改造及发酵条件优化提高人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的表达量

通过微生物异源表达胶原蛋白能够避免传统提取方法存在的有致病隐患和水溶性低的问题,也能突破化学合成方法对胶原蛋白长度的限制,使得对胶原序列的设计更加灵活.本文合成了截短的人源Ⅲ型胶原蛋白N-HC3240基因,为提高其在毕赤酵母中的表达量,通过启动子改造策略,研究了启动子AOX1、DAS1、DAS2、FLD1、FDH1、THI4和THI11对N-HC3240在毕赤酵母GS115中表达的影响,结果表明AOX1启动子是N-HC3240时空表达量最优的启动子.此外,对AOX1启动子的启动表达,进行了溶氧、初始诱导菌体浓度、诱导pH值和甲醇浓度的优化,最终N-HC3240在摇瓶水平的产量达到0.28 g/L,是优化前的2.5倍,并通过质谱鉴定了N-HC3240的序列.本研究为人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的异源高效表达提供了一定的研究基础.

不同碳源下毕赤酵母GS115蛋白组学分析

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染问题;并能够对目的蛋白进行类似于高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等蛋白翻译后加工。但是不论是胞内表达或是分泌表达,大多数外源蛋白均面临着被降解的问题,这也是影响目的蛋白表达量的一个重要因素,同时还增加了纯化目的蛋白的难度。目的:研究毕赤酵母GS115在不同碳源培养过程中胞内外蛋白质组学的差异,指导毕赤酵母表达系统的优化。方法:利用LC-ESI-MS/MS方法分析了不同碳源的四种培养基中毕赤酵母GS115的胞内和胞外蛋白种类,利用Griffin等的计算方法计算各个蛋白的含量。结果:利用LC-ESI-MS/MS结合Griffin等的归一化非标定量法SIN得到GS115胞内胞外详尽的蛋白质种类及准确百分比含量。结论:分析不同培养基之间蛋白质组成的差异,从而为以后构建新的毕赤酵母表达体系,为外源蛋白表达系统的优化提供一定的指导意义。

超耐热酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在酵母细胞中的表达

用PCR方法扩增来源于极端嗜热厌氧古菌Pyrococcus furiosus中的超耐热酸性α-淀粉酶的结构基因，将该结构基因引入载体pPIC9K中，将重组质粒pPIC9K—Amy转化大肠杆菌DH5α细胞，测序结果表明，克隆到的α-淀粉酶结构基因为1305bp，其编码的成熟肽为435个氨基酸。将正确构建的重组质粒转化毕赤酵母GS115细胞，得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下，超耐热酸性α-淀粉酶在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外，该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导，随着诱导培养时间的增加，在培养基上清液中的单位体积酶活力相应上升，在诱导培养7d后酶活力达到最大值。该酶最适反应温度为90-100℃，最适反应pH值为4．5—5．5。该酶具有非常好的温度稳定性，在100℃条件下热处理5h。仍具有60％以上的酶活力。该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。