HBscFv-IFNγ在毕赤酵母X33中的表达、纯化及鉴定

为了有效治疗乙肝病而研究了将抗乙肝病毒表面抗原单链抗体(single-chain Fv against HBV surface antigen,HBscFv)与临床治疗乙肝常用的γ-干扰素(γ-interferon,IFNγ)连接的融合蛋白(HBscFv-IFNγ)。采用重叠PCR法将基因hbscfv与ifnγ连接成hbscfv-ifnγ,再构建成多拷贝重组质粒pPICZαA/(hbscfv-ifnγ)1,2,4,然后转入巴斯德毕赤酵母X33。从中筛选出的工程菌株X4能够分泌表达目的蛋白HBscFv-IFNγ,并用SDS-PAGE、Western blotting和ELISA方法进行了初步鉴定,结果表明组成HBscFv-IFNγ的HBscFv和IFNγ仍具有生物学活性。用14F7亲合层析纯化X4的发酵液可获得纯度达95%～98%的HBscFv-IFNγ。它可中和HBV转基因小鼠血清中27.9%的乙肝病毒表面抗原(HBV surface antigen,HbsAg),这表明HBscFv-IFNγ上的抗体能够与生物体内的HBV有效结合。可见,HBscFv-IFNγ将是一种防治乙肝病而有开发前景的靶向新药。

重组猪胰蛋白酶原及其突变体在毕赤酵母X33中的组成型表达

目的:设计以PGAP为启动子的组成型质粒,构建高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得重组猪胰蛋白酶。方法:首先将质粒转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,电转化至毕赤酵母X33,表达重组猪胰蛋白酶原,经肠激酶激活,纯化提取得到重组猪胰蛋白酶。结果:筛选到高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得了重组猪胰蛋白酶。结论:以PGAP为启动子的质粒,转化毕赤酵母X33后表达的重组猪胰蛋白酶原避免了补加甲醇带来的危害,且操作方便,大大缩短了周期,提高了生产效率,避免了动物源性污染。

人源极光激酶A在毕赤酵母和MCF-7细胞中的表达及纯化

目的:构建人源极光激酶A(AURKA)真核表达载体,检测其在毕赤酵母X33和MCF-7细胞中的表达及纯化。方法:将双酶切PCR扩增的目的基因与真核表达载体连接,构建重组质粒。电转法转染重组质粒,筛选后采用SDS-PAGE和Western blotting法检测AURKA蛋白的表达,Ni-NTA柱法纯化表达的蛋白;放射自显影法检测AURKA的生物活性;细胞计数法检测转染重组质粒后MCF-7细胞增殖情况。结果:2种重组质粒经PCR均扩增出1 212bp目的基因,表明真核表达载体构建成功。重组AURKA蛋白相对分子质量约为50 000,且可磷酸化其底物组蛋白H3,表明重组AURKA具有活性。与转染空质粒和野生型MCF-7细胞比较,转染AURKA 24和48h后MCF-7活细胞数量明显增加。结论:AURKA在毕赤酵母和MCF-7细胞中成功表达和纯化,且其过表达可促进细胞增殖。

两种葡萄糖氧化酶基因分别在酿酒酵母及毕赤酵母中的重组表达

从Aspergillus niger CICC 40179中克隆得到了葡萄糖氧化酶(GOD)基因,并在酿酒酵母AS2.489中通过载体p2μRCMB进行重组表达.合成来源于A.niger的一段GOD基因(美国专利号为5094951),同时对其进行了少量密码子的同义替换以避免部分酶切位点,将该段合成的序列通过甲醇诱导型载体p PICZαA在毕赤酵母X33中进行了重组表达.比较分析两种葡萄糖氧化酶的分泌表达情况.

油橄榄苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用同源克隆、反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、融合引物嵌套PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)与3’-c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术相结合,从油橄榄(Olea europaea)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)基因全长,命名为Oe PAL。序列分析表明,Oe PAL的DNA全长2 970 bp(Gen Bank登录号KJ511867),含一个内含子(393~1 220 bp);全长c DNA有2 142 bp(Gen Bank登录号KJ511868),开放阅读框编码713个氨基酸,与其他植物有较高的同源性。利用该基因构建重组质粒p PICZαA-Oe PAL,且在毕赤酵母X33中进行诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)检测显示该重组酶的分子质量在77.5 k D左右,纯化后的酶比活力为196.3 U/mg。酶学性质研究表明:该重组酶的最适反应条件为40℃,p H 8.8;在供试范围内Cu2+与Na+可以提高该酶活性;以L-苯丙氨酸为底物,在最适条件下该酶的Km为4.89×10-4 mol/L。结果表明成功地克隆到Oe PAL,构建了表达载体,并进行了功能验证。