转录因子Prm1和Mit1对毕赤酵母产外源蛋白的影响

【目的】研究转录因子Prm1和Mit1在毕赤酵母表达外源蛋白中的作用,为提高毕赤酵母中的外源蛋白产量提供参考。【方法】以毕赤酵母GS115为出发菌构建8种菌株,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,过表达Prm1、Mit1或敲除Prm1、Mit1和Mxr1,以GFP的表达量为指标,分析其对毕赤酵母产外源蛋白的影响。在甲醇和甘油2种碳源下,利用实时定量PCR分析Prm1和Mit1在转录水平的表达情况,探究Prm1和Mit1的关系。【结果】成功构建了表达GFP的菌株、单因子过表达Prm1和Mit1的菌株及敲除Prm1、Mit1、Mxr1的菌株等8种菌株。利用P AOX1诱导型过表达Prm1,毕赤酵母细胞内的GFP表达量极显著提高(P<0.01),而用P_(GAP)组成型过表达Prm1,GFP的表达量无明显变化;利用P_(AOX1)诱导型和P_(GAP)组成型过表达Mit1,GFP表达量均极显著提高(P<0.01),较对照分别提高3.2和2.5倍;敲除Prm1后,GFP的表达量显著下降(P<0.05);敲除Mit1后,GFP几乎不能发出荧光。实时荧光定量PCR结果显示,在甲醇和甘油2种碳源下,敲除Prm1后Mit1少量表达,敲除Mit1后Prm1大量表达。【结论】利用P_(AOX1)诱导型过表达Prm1、Mit1和利用P_(GAP)组成型过表达Mit1,均能提高GFP在毕赤酵母细胞内的表达量。Prm1和Mit1可作为正调控因子在毕赤酵母产外源蛋白中发挥作用,且Prm1能激活Mit1,Mit1可反馈抑制Prm1。

毕赤酵母作为基础研究的新兴模式生物研究进展

毕赤酵母Komagataella phaffii已经被广泛应用于生物技术行业,近年来,其作为模式生物的潜力逐渐受到关注。目前,酿酒酵母是最常用酵母模型,毕赤酵母与酿酒酵母在2.5亿年前分化,相比酿酒酵母,毕赤酵母进化速度较慢,更多保留了古代酵母祖先的特征,还具有利用甲醇作为唯一碳源生长的能力,这些特征使其成为研究真核生物分子细胞生物学的有价值模式生物。本文总结了毕赤酵母基础生物学方面的研究成果,包括甲醇同化、过氧化物酶体生成、交配与产孢行为,以及蛋白质分泌、脂质合成和细胞壁形成等过程,旨在全面且系统地综述毕赤酵母作为模式生物的研究进展。

一株脱氮毕赤酵母Y 4的分离鉴定及其氨氮降解性能

当前水体氨氮污染严重,环境治理迫在眉睫,筛选高效安全的脱氮菌株可为废水脱氮提供更多选择。本研究从沼气发酵污泥中分离筛选能降解氨氮的菌株,使用18S rDNA序列分析,对筛选出的优良菌株进行种类鉴定;同时采用单因素试验和正交试验,探究菌株最佳脱氮条件[培养温度、初始pH值、盐浓度、碳氮比(C/N)]及其硝化、反硝化能力。结果表明,分离筛选得到1株具有较强脱氮能力的野生型毕赤酵母(Pichia sp.)菌株Y 4。在试验优化后,得到菌株Y 4的最适脱氮条件:培养温度25℃,初始pH值8.0、盐浓度(氯化钠浓度)30 g/L、C/N为30。在培养24 h后菌株Y 4对亚硝酸氮(NO-2 N)的降解率为80.50%,在培养48 h后菌株Y 4对氨氮(NH+4 N)的降解率达99.92%,且在24 h内菌株Y 4的异养硝化和好氧反硝化的速率分别达到6.25和6.71 mg/(L·h),表明毕赤酵母菌株Y 4对废水氮污染处理以及生物修复具有一定的应用价值与潜力。

分子伴侣增强蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及对羊毛鳞片层的作用分析

【目的】通过分子伴侣共表达增强毕赤酵母中异源蛋白酶K的分泌水平,并对其的羊毛无氯剥鳞作用机制进行解析,旨在提高蛋白酶K的表达量并为高效酶法剥鳞技术的应用奠定基础。【方法】利用毕赤酵母表达系统对tprK基因进行异源表达,首次分析了影响蛋白质折叠和质量控制的分子伴侣Ssa1、Erj5、Sil1、Hac1、Kar2、Lhs1和Ydj1分别过表达对TPRK的表达量和酶活力的作用,并对TPRK处理的羊毛纤维效果进行分析。【结果】TPRK在毕赤酵母GS115中表达,其最适反应条件为65℃、pH 9.0,且具有良好的热稳定性和pH稳定性。过表达ssa1、hac1、erj5和sil1基因的重组菌株酶活分别提升了36.8%、20.0%、17.7%和14.8%。5 L发酵罐进行高密度发酵,诱导72 h后,TPRK的酶活达到77471.99 U/mL。在羊毛水解应用中TPRK可水解羊毛鳞片内层使鳞片逐渐剥落,起到剥鳞效果,并且最适水解条件为:TPRK添加量为300 U/mL、反应温度55℃、pH 9.0和反应时间2 h。【结论】过表达分子伴侣Ssa1能够有效提升TPRK的表达量,利用该TPRK处理羊毛纤维,可有效去除羊毛鳞片层,而对羊毛核心皮质层造成的损伤较小。

毕赤酵母分泌型遗传操作工具的构建与优化

为了解决毕赤酵母遗传操作效率低且流程繁琐的问题,提高其应用价值,构建并优化了分泌型遗传操作工具。首先,以α-淀粉酶为报告蛋白,通过融合自主复制序列构建非整合型表达质粒;其次,借助通用引物和POE-PCR,快速筛选评估与目的蛋白最匹配的内源信号肽;最后,构建以亚磷酸盐为唯一磷源的营养依赖型筛选标记。结果表明:2种非整合型质粒表达α-淀粉酶的酶活分别是整合型质粒的2倍和1.6倍;以FLO10、EXG1和MSB 2为信号肽引导的α-淀粉酶酶活分别是常规信号肽α-MF的2.5倍、1.94倍和1.75倍;亚磷酸脱氢酶基因(ptxD)成功筛选出异源表达α-淀粉酶的重组菌株。研究简化了基因操作流程,改进了遗传操作工具,开发的绿色安全且低成本的营养依赖型筛选标记,有助于毕赤酵母分泌表达系统的应用和推广。

过敏原肌质钙结合蛋白在毕赤酵母中的表达、优化及免疫反应性研究

目的 利用毕赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)高效表达三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)重要过敏原肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein, SCP),并检验其免疫反应性。方法 根据毕赤酵母的密码子偏好性优化SCP基因并构建重组质粒。将其热激转化至P. pastorisGS115菌株后经遗传霉素(geneticin,G418)筛选获得阳性高拷贝子。最后通过甲醇诱导表达重组SCP并结合免疫印记(western blotting,WB)和间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)验证其免疫反应性。结果 在摇瓶水平下,重组SCP在毕赤酵母中最佳的表达条件为:诱导温度为28℃,甲醇添加量为每24h添加1.0%甲醇,诱导pH为6.0,诱导时间为144 h。在此条件下, SCP(纯度为91.6%)的得率为1.5 mg/100 mL菌液,实现了可溶性高效表达。WB和间接ELISA结果表明,重组SCP具有免疫球蛋白G结合能力。结论 毕赤酵母表达系统可以得到纯度较高且免疫反应性良好的重组SCP。本研究可为SCP的理化研究及过敏原标准物质的应用奠定基础,并有望促进特异性甲壳类过敏原检测的发展。

毕赤酵母外源蛋白分泌及折叠途径的改良进展

工业、农业和医药等领域常用的活性蛋白和工业酶大多数通过异源表达系统获得。毕赤酵母(Pichia pastoris)是优秀的外源蛋白表达宿主之一,以毕赤酵母为宿主的表达系统具有遗传稳定性好、翻译后修饰、蛋白表达和分泌水平高及生产成本低等优点,但在高效表达过程中外源蛋白过量聚集会导致目标蛋白不能正确折叠和有效分泌,从而影响蛋白表达水平。概述了通过信号肽优化、分子伴侣优化以及融合蛋白表达等分泌及折叠途径的改良,从而促进外源蛋白高效表达的研究进展。

基于响应面法优化库德毕赤酵母强化发酵工艺生产清香型白酒

为了稳定和提升清香型白酒中乙酸乙酯的含量,以高产乙酸乙酯库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)FJZ强化发酵生产清香型白酒。以酒醅中乙酸乙酯和总酯含量为评价指标,采用单因素试验探究接种量、大曲添加量、料液比、发酵时间、发酵温度对清香型白酒酒醅中乙酸乙酯和总酯含量的影响,并在此基础上,基于响应面法优化发酵工艺条件。结果表明,最佳发酵工艺条件为:接种量4%、大曲添加量10%、料液(高粱与水)比1∶1(g∶mL)、发酵时间21 d、发酵温度27℃。该优化条件下,酒醅中总酯含量为(4.75±0.06)g/kg,乙酸乙酯含量为(1.25±0.02)g/kg,分别比未强化发酵提高了55.74%和76.06%。

四种过氧化物酶体同工酶在毕赤酵母甲醇代谢中的作用研究

利用毕赤酵母进行甲醇生物转化具有广泛的应用前景。为了深入了解该酵母甲醇代谢机理,该文以甲醇利用途径的4个过氧化物酶体同工酶为研究对象展开研究,分别为D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶2(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase,Rpe1-2),核糖-5-磷酸异构酶2(ribose-5-phosphate isomerase,Rki1-2),转醛醇酶2(transaldolase,Tal1-2),果糖-1,6-二磷酸醛缩酶2(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,Fba1-2)。在验证其参与甲醇代谢的基础上,分别对4个酶基因进行单敲除、四敲除,并在四敲除菌中分别进行细胞质同工酶及过氧化物酶体同工酶的回补实验。结果表明4敲除菌在甲醇培养基中受到严重的生长抑制。而单敲除菌中,Fba1-2的缺失对菌株在甲醇培养基中的生长表型影响最大;同时,回补Fba1-2也能最大程度地恢复4敲除菌株的生物量。综上,Fba1-2是甲醇同化途径中的关键酶,且同化途径的过氧化物酶体区室化对甲醇代谢途径至关重要。此外,景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(sedoheptulose-1,7-bisphosphatase,Shb17)基因单敲除菌和TAL1-2基因单敲除菌的表型对比结果表明,更改的卡尔文循环是甲醇代谢中木酮糖-5-磷酸(xylulose 5-phosphate,XU5P)再生的主要途径。该研究可为后续优化毕赤酵母甲醇利用途径提供理论依据。

絮凝技术在毕赤酵母发酵液固液分离中的应用研究

试验旨在采用絮凝技术对毕赤酵母发酵液进行固液分离。以菌体絮凝率和酶活回收率为测定指标,采用单因素试验和正交试验,研究不同絮凝剂对重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶发酵液絮凝效果的影响。结果显示,毕赤酵母发酵液最佳絮凝工艺为先加入2.0%聚合氯化铝,再加入1.0%硅藻土,最后加入0.2%阳离子型聚丙烯酰胺,且聚合氯化铝母液添加体积不超过发酵液总体积的20%。在此条件下,发酵液菌体絮凝率达90%以上,葡萄糖氧化酶的酶活回收率达85%以上。研究表明,采用絮凝技术能够对毕赤酵母发酵液进行固液分离,该方法有利于提高酶的生产效益,从而促进饲用酶制剂行业发展。

膜醭毕赤酵母KD-316-3复合保鲜液的抑菌机制与初步应用

该研究制备一种含10^(8) CFU/mL膜醭毕赤酵母KD-316-3(Pichia membranaefaciens KD-316-3)的海藻糖基复合保鲜液,以果实黑斑病菌链格孢霉菌(Alternaria species)为对象进行离体抑菌研究,并进行复合保鲜液的冬枣应用保鲜试验,用以探究复合保鲜液的抑菌机制和应用效果。试验结果表明,在离体条件下,复合保鲜液处理能抑制病原链格孢霉菌的生长,拮抗效率26.48%,使病原菌菌丝生长畸形,电解质外渗,菌丝体核酸泄漏,胞内可溶性蛋白含量降低;在冬枣贮藏过程中,复合保鲜液能抑制冬枣果实失重率的上升,有效减缓冬枣果实的病斑腐烂,对果实丙二醛含量及多酚氧化酶活性也产生明显影响,提高过氧化物酶活性。综合分析,使用膜醭毕赤酵母KD-316-3复合保鲜液处理冬枣果实可抑制病原菌引起的腐烂,维持果实良好品质。

大肠杆菌L-丝氨酸脱水酶的表达改善甘氨酸营养缺陷型毕赤酵母L-丝氨酸的生长

氨基酸作为一种迟效碳源无法被微生物快速利用。L-丝氨酸脱水酶(L-serine dehydratase,L-SerDH)可以将L-丝氨酸一步催化为丙酮酸和氨进入中心碳代谢生成生物量,且此过程不需要消耗ATP和还原力。L-丝氨酸是甲酸利用途径(还原性甘氨酸途径)的关键中间体。因此,改善L-丝氨酸的利用可以为甲酸和丝氨酸作为碳源利用提供参考价值。该文对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)进行了丝氨酸耐受性实验,结果显示毕赤酵母可以耐受20 g/L丝氨酸。对内源L-丝氨酸脱水酶在毕赤酵母中的表达进行了优化。在甘氨酸营养型毕赤酵母内分别表达了8种异源L-丝氨酸脱水酶,结果表示大肠杆菌tdcG基因编码的L-SerDH对丝氨酸利用改善效果最好,终OD 600提高至出发菌株的1.6倍。该研究验证了巴斯德毕赤酵母对L-丝氨酸的耐受性,并筛选得到了较优的L-丝氨酸脱水酶来源,为毕赤酵母的丝氨酸利用提供了更优的酶来源。

毕赤酵母中外源蛋白表达量的提升策略

利用异源重组表达系统表达外源蛋白是基因工程研究的重点。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲基营养型酵母,由于其易于遗传操作、高水平分泌外源蛋白、翻译后修饰等特点,已成为工业应用中蛋白质生产的重要菌株,常被用于酶制剂的生产。然而,部分外源蛋白在毕赤酵母系统中的表达水平较低,仍有待提升的空间。因此,进一步探索提升毕赤酵母中外源蛋白表达量的原理和方法,将对降低毕赤酵母表达系统工业化生产成本,提高经济效益,具有重要的意义。本文主要从基因水平、转录水平、翻译水平、折叠分泌水平、抗逆水平、发酵工艺六个方面归纳总结了近年来毕赤酵母提高外源蛋白表达的优化策略的研究进展,旨在为提高外源蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达水平提供有益参考。

基于毕赤酵母制备的SARS-CoV2RBD-重组蛋白疫苗的免疫方案优化及不同佐剂对中和抗体滴度的影响

目的对基于毕赤酵母制备的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD重组蛋白疫苗的免疫方案进行优化并考察不同佐剂对中和抗体(NAb)滴度的影响,为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供参考。方法将RBD基因片段亚克隆至pPICZαA质粒,质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达,将获得的重组蛋白疫苗联合不同的佐剂对小鼠进行免疫以评估其免疫原性。结果目标蛋白wtRBD和Delta RBD均能通过毕赤酵母系统获得满意过表达;与42 d间隔时间相比,28 d间隔时间的IgG抗体滴度增加了1.8倍(44923 vs.80507);间隔28 d的3剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度比间隔42 d高2.5倍(2191 vs.891);Delta RBD重组蛋白疫苗联合铝佐剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度达到了32255(2167~88084);在采用5μg或30μg Delta RBD免疫情况下,铝佐剂+CpG佐剂组的NAb滴度均为单独采用铝佐剂组的10倍左右;第3次免疫后,5μg抗原组与30μg抗原组中Delta RBD特异性IgG滴度差异无统计学意义(P>0.05)。结论基于毕赤酵母制备的wtRBD或Delta RBD都可以用作有效的抗原,间隔28 d的3剂疫苗给药最有效,Delta RBD重组蛋白与铝佐剂+CpG佐剂的联合免疫能够获得更高滴度的NAb以对SARS-CoV-2及其变体发挥免疫作用,可为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供一定参考。

β-葡萄糖苷酶催化活性改造及在毕赤酵母中的高效表达

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)能催化底物非还原末端的β-D-葡萄糖苷键水解释放葡萄糖和相应配基,是纤维素糖化过程中的关键酶之一。篮状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)来源的β-葡萄糖苷酶bgl3A热稳定性较好,但催化活性还亟待提高。该研究中,通过Discovery Studio 2022柔性对接模块构建了bgl3A和底物pNPG的复合物结构;基于结合能预测模块对bgl3A催化活性位点6以内的氨基酸残基进行虚拟突变,计算突变前后酶对pNPG的结合能变化;对结合能变化小于-0.7 kcal/mol的20个突变体进行表达、纯化和酶学性质分析。与bgl3A相比,突变体bgl3A-N237Y的比酶活和k_(cat)/K_(m)分别提升了22%和25%。将bgl3A-N237Y在毕赤酵母中表达,通过信号肽替换和共表达分子伴侣使其摇瓶发酵酶活力达106.6 U/mL,较优化前提高75%。研究得到高活性bgl3A突变体及其生产菌将有助于提高其工业化应用效果。

耐热嗜酸β-甘露聚糖酶TaMan5A在毕赤酵母中高效表达及酶学性质研究

甘露聚糖酶是一类将甘露聚糖降解为短链甘露寡糖及甘露糖的水解酶。为了开发耐酸耐高温的工程酶,从棘孢木霉(Trichodema asperellum)ND-1中克隆甘露聚糖酶基因TaMan5A并在毕赤酵母(Komagataella phaffii)X-33中成功表达。结果显示,该酶的蛋白质分子质量约为67 kDa。最适pH值和温度分别为4.0和65℃,在pH 2.0~6.0具有较强的稳定性,孵育1 h后仍具有80%的活性,且在20~65℃时,残留酶活力均能达到90%以上。1 mmol/L Co^(2+)、脲和5 mmol/L SDS、Zn^(2+)、Fe^(2+)、Mn^(2+)、Ni^(2+)对TaMan5A的活力都有不同程度的激活作用。由于玉米秸秆富含纤维素与半纤维素,因此进一步确定了TaMan5A水解秸秆的最佳组合条件(玉米秸秆用量0.5 g,TaMan5A用量0.5 g,pH 4.0,水解2 d),并得到玉米秸秆用量和TaMan5A用量对玉米秸秆降解效率影响最大。该研究首次从棘孢木霉ND-1中克隆出TaMan5A基因,实验结果表明,TaMan5A是一种嗜酸、耐高温、热稳定性强的酶,具有较大的应用前景,值得进一步研究。

四联鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ毕赤酵母重组质粒构建及其表达

利用重组毕赤酵母表达四联鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ以实现高效制备。根据鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ的氨基酸序列,以及胰弹性蛋白酶和羧肽酶A的特异性裂解位点,设计四联鲎抗菌肽(4Tp Ⅱ)序列,按照毕赤酵母密码子偏好性进行优化,经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后构建重组质粒pPICZαA-4Tp Ⅱ,电转至毕赤酵母X-33,利用Zeocin抗性筛选阳性转化子,经甲醇诱导表达后SDS-PAGE分析。成功构建重组质粒pPICZαA-4Tp Ⅱ,并筛选出阳性转化子,经30℃、250 r/min、1%甲醇诱导表达5 d后,获得重组蛋白,可为高效制备鲎抗菌肽Tachyplesin Ⅱ奠定基础。

库德里阿兹威氏毕赤酵母与酿酒酵母混菌发酵对威士忌挥发性香气成分的影响

本文采用气相色谱质谱联用法(GC-MS)、气味活度值(OAV)等,探讨库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)混菌发酵对威士忌挥发性香气成分的影响。结果表明,混菌发酵的发酵液理化指标良好(pH值为4.20,酒精度为4.79%vol,总酸含量为2.39g/L,单位麦芽出酒率为24.68mL/100g);挥发性香气成分最多(16种,32.85mg/50mL),OAV>1的物质种类最多(4种),其中己酸乙酯OAV值最高(119.28);感官评价得分最高(92.9分)。综上所述,P.kudriavzevii与S.cerevisiae混菌发酵能增加威士忌中挥发性香气成分。

异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的影响

本试验旨在探究添加异常毕赤酵母和纤维素酶对甜高粱青贮质量及微生物多样性的动态影响,并采用隶属函数法对青贮质量进行综合评价,以筛选适宜添加剂。试验设置纤维素酶组(CE组)、异常毕赤酵母组(PA组)、异常毕赤酵母+纤维素酶组(PC组)3个添加剂组和1个空白对照组(CK组),分别于青贮第7、14和21天时对其感官质量、常规营养成分含量、发酵品质以及微生物群落结构进行分析。结果表明:1)3个添加剂组酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量在青贮第21天时均显著低于CK组(P<0.05),相对饲喂价值显著高于CK组(P<0.05)。PA组在青贮第21天时可溶性碳水化合物、粗蛋白质和淀粉含量均显著高于其他3个组(P<0.05),主要营养成分保存良好。2)整个青贮过程中,4个组pH、氨态氮/总氮值以及有机酸组成和含量均处于优良青贮范围。基于隶属函数法分析发现,青贮第21天时PA组隶属函数值平均值最高,青贮质量综合评价效果最好。3)4个组在属水平上的微生物群落包含泛菌属(Pantoea)、明串珠菌属(Leuconostoc)和肠杆菌属(Enterobacter)以及少量乳杆菌属(Lactobacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)、片球菌属(Pediococcus)和葡糖杆菌属(Gluconobacter)等28个属。PA组在整个青贮期间乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、魏斯氏菌属(Weissella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和肠球菌属(Enterococcus)等6种乳酸菌总相对丰度为19.05%~23.61%,同时含有较高相对丰度的泛菌属和葡糖杆菌属,通过优化细菌群落结构形成了一种新的稳定的青贮微生态体系。综上所述,添加异常毕赤酵母可以明显改善甜高粱的青贮质量,有望成为一种经济高效且适用于甜高粱的专用青贮添加剂。

一株毕赤酵母菌MC-1降解呕吐毒素、生物学特性及初步应用

呕吐毒素(DON)是危害动物健康的霉菌毒素之一,本研究旨在分离出能够降解DON的益生菌,以期应用于动物饲料中降解DON。本研究从普洱茶叶中分离出一株益生菌,经16S rDNA基因序列比对确定该菌株为毕赤酵母菌MC-1菌株;其在含有DON(1 mg/L)发酵液中DON降解率为59.21%。此外研究了毕赤酵母菌MC-1生物学特性,活性成分定位和应用试验。结果表明:毕赤酵母菌MC-1具有耐盐、耐酸、耐胆盐及在模拟消化液中存活的特性;其发酵上清液(DON 1 mg/L) DON降解率为54.76%,该菌株与(DON 1 mg/kg)豆粕共同发酵48 h后DON降解率为46.79%。综上,毕赤酵母菌MC-1能够用于动物发酵饲料中降解DON。