含毛喉素的条件培养液诱导脂肪来源干细胞神经分化的体外实验研究

目的:利用神经诱导液体外诱导大鼠脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)神经分化,探索对ASCs体外成神经分化的最佳毛喉素浓度,并研究该浓度的培养液对ASCs体外成神经分化的作用。方法:酶消化法获得原代ASCs,通过流式细胞术和细胞染色鉴定ASCs的表型和多向分化能力。体外用含不同浓度毛喉素的神经诱导条件培养液进行神经诱导分化,采用免疫荧光染色技术筛选最佳浓度。采用含最佳浓度毛喉素的神经诱导条件培养液诱导ASCs,镜下观察诱导前后细胞的形态学特征,采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和免疫荧光检测诱导前后细胞中神经分化标志物的mRNA和蛋白表达变化情况。结果:神经诱导条件培养液中毛喉素的最佳浓度为10μmol/L,含该浓度毛喉素的神经诱导条件培养液诱导的细胞,能够迅速诱导ASCs向成神经方向分化。诱导后,细胞形态类似神经细胞,神经细胞标志物抗β-Ⅲ微管蛋白(classⅢβ-tubulin,Tuj1)、神经丝蛋白(neurofilament-M,NF-M)、巢蛋白(nestin)抗体和S100β的mRNA水平和蛋白水平均表达增加(P<0.05)。结论:含毛喉素浓度为10μmol/L的诱导培养液能诱导ASCs神经分化,诱导细胞有望成为周围神经种子细胞。

毛喉素对猪卵母细胞降脂及冷冻保护效果研究

猪卵母细胞脂质含量高被认为是其冷冻效率低下的重要因素之一。本文通过在猪卵母细胞体外成熟过程中添加化学降脂剂毛喉素(forskolin),检测冷冻前后成熟卵母细胞的脂滴含量、脂滴超微结构、线粒体膜电位、活性氧水平、早期凋亡指标、冻后存活率及发育潜能变化等,研究其对猪卵母细胞降脂和冷冻保护的效果。结果显示,成熟过程中毛喉素处理可部分提高卵母细胞成熟率,但差异不显著(P>0.05)。尼罗红荧光染色显示,毛喉素处理后卵母细胞内脂滴数量及面积在冷冻前后均极显著低于未处理组(P<0.01);超微结构观察发现,经毛喉素处理的卵母细胞中非均质脂滴数量与均质脂滴数量的比例扩大,且比均质脂滴面积更大;冷冻后,卵母细胞中以非均质脂滴为主,脂滴变小变少,分布不均匀,毛喉素处理后非均质与均质间的脂滴数量比例进一步增加。毛喉素处理极显著上调冻后卵母细胞线粒体膜电位(1.04 vs. 0.51,P<0.01),减轻氧化应激,降低早期凋亡率(68.30%vs. 86.03%,P<0.01),从而有效提高了冷冻后卵母细胞的存活率(71.17%vs. 51.47%,P<0.01)和孤雌激活卵裂率(16.63%vs. 8.23%,P<0.05)。本研究表明,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加毛喉素可有效降低细胞内脂质含量,并通过降低氧化损伤和改善线粒体功能,达到提高冻后存活率和发育能力的目的。

硼替佐米联合毛喉素诱导硼替佐米耐药骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

背景与目的:硼替佐米作为蛋白酶体抑制剂已成为新诊断和复发多发性骨髓瘤患者临床治疗的主要药物,但仍有部分患者对硼替佐米产生耐药而影响其长期生存。近年来研究发现,提高细胞内环腺苷酸浓度可以诱导骨髓瘤细胞凋亡并延缓其生长,成为骨髓瘤治疗新途径。该研究通过观察硼替佐米联合腺苷酸环化酶激动剂毛喉素(forskolin)对硼替佐米耐药骨髓瘤细胞的作用,探究克服骨髓瘤耐药的可能途径及其机制。方法:以硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株H929-R和原代细胞为模型,通过观察细胞生长、形态、凋亡相关基因的改变来研究硼替佐米、毛喉素单独或联合处理对硼替佐米耐药细胞增殖及凋亡的影响;并应用Rh123/PI双染法检测药物处理前后细胞内线粒体跨膜电位的变化;同时采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)检测线粒体凋亡相关基因转录水平及抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1的蛋白水平的改变。结果:硼替佐米(20 nmol/L)与毛喉素(50 nmol/L)能够协同诱导硼替佐米耐药细胞凋亡。进一步研究发现,毛喉素可协同硼替佐米促使耐药细胞内线粒体跨膜电位下降并下调其Bcl-2和Mcl-1蛋白的表达。结论:毛喉素联合硼替佐米能够诱导硼替佐米耐药骨髓瘤细胞凋亡。

小分子化合物毛喉素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤诱导骨髓间充质干细胞分化为许旺细胞样表型的可能性

背景:周围神经损伤是一种主要由创伤等因素引起的临床常见疾病,研究表明,由骨髓间充质干细胞转分化的许旺细胞可以促进周围神经损伤的修复与重建,但其诱导方法尚未达成共识,并且细胞神经转分化的机制仍尚不明确。目的:探讨小分子化合物(毛喉素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)诱导骨髓间充质干细胞分化为许旺细胞的可行性,以及该诱导过程与cAMP/PKA通路的相关性。方法:采用全骨髓贴壁法从1周龄SD乳鼠四肢骨骨髓中提取出原代骨髓间充质干细胞,运用细胞免疫荧光对其进行鉴定,并用CCK-8法检测各代骨髓间充质干细胞在不同培养时间点的增殖活性变化,以小分子化合物对骨髓间充质干细胞进行体外诱导分化,实验分为3组:对照组用神经生长培养基处理120 h、诱导组用神经生长培养基+毛喉素+3-异丁基-1-甲基黄嘌呤处理120 h、抑制组用神经生长培养基+毛喉素+3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+cAMP抑制剂SQ22536处理120 h,每60 h更换1次培养基。通过细胞形态学、Western blot等技术对许旺细胞样细胞进行鉴定及相关分析,同时检测分化过程中cAMP相关蛋白的表达。结果与结论:①细胞免疫荧光染色显示分离培养的原代细胞能够被CD44和CD90标记,CCK-8结果显示在相同培养时间点,第1-3代骨髓间充质干细胞增殖活性逐渐增加,第3-6代骨髓间充质干细胞增殖活性逐渐降低;②Western blot结果显示小分子化合物诱导后许旺细胞特异性标志物S100β、GFAP和p75以及cAMP相关蛋白p-CREB表达均明显增加(P<0.001;P<0.001;P<0.05;P<0.0001),而cAMP/PKA抑制剂SQ22536可以抑制这一效应(P<0.01;P<0.01;P<0.05;P<0.001);③结果表明,该小分子化合物可以诱导骨髓间充质干细胞分化为许旺细胞表型,并且诱导过程中可能激活了cAMP/PKA通路。

毛喉素诱导猪卵泡颗粒细胞体外分化机制的研究

[目的]本试验旨在研究毛喉素(FSK)对体外培养的猪卵泡颗粒细胞分化的作用及机制。[方法]体外分离培养猪原代卵泡颗粒细胞,预培养24 h。用10 nmol·L^-1 FSK处理细胞48 h,检测细胞形态、脂滴积聚、标记基因和周期相关基因表达状况;处理96 h后检测孕酮(P 4)水平及类固醇合成相关蛋白的表达水平。[结果]与对照组相比,FSK改变了细胞形态,使细胞直径增大,细胞内脂滴含量增加(P<0.01);FSK降低细胞的增殖活性和增殖细胞核抗原(PCNA)基因表达水平(P<0.01);FSK降低颗粒细胞标记基因促卵泡素受体(FSHR)基因表达水平,提高黄体细胞标记基因前列腺素受体(PTGFR)和促黄体素受体(LHCGR)基因表达水平(P<0.01);FSK促进P 4分泌,提高了类固醇合成相关蛋白StAR、P450scc和3β-HSD的表达水平(P<0.01);从细胞周期看,FSK降低了细胞周期素B1(CCNB 1)、细胞周期素D1(CCND 1)和细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK 1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK 2)基因表达水平(P<0.01),而使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A/B(P 21 cip1/P27 kip1)基因表达水平上调(P<0.01),并将细胞周期阻滞在G0/G1期。[结论]FSK能够通过抑制细胞增殖、增强脂滴积聚和孕酮合成代谢以及退出细胞周期来促进颗粒细胞向黄体细胞转化。

睫状神经营养因子复合毛喉素及3-异丁基-1-甲基黄嘌呤通过环磷酸腺苷信号通路诱导肌源性干细胞分化为许旺细胞表型

背景:许旺细胞是周围神经组织工程最理想的种子细胞,但许旺细胞存在诸多缺陷,因此目前的研究主要集中在具有许旺细胞特性的其他细胞上,并且许旺细胞样细胞已成为周围神经损伤修复的理想细胞来源。目的:探讨睫状神经营养因子复合毛喉素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Fsk-IBMX)诱导肌源性干细胞分化为许旺细胞表型的方法及该诱导过程与环磷酸腺苷信号通路的相关性,以期为进一步将肌源性干细胞应用于周围神经损伤修复奠定基础。方法:采用混合消化酶从1周龄SD乳鼠中提取肌源性干细胞,以睫状神经营养因子诱导肌源性干细胞去分化,再用Fsk-IBMX对去分化肌源性干细胞进行诱导。通过细胞形态学、细胞免疫荧光、CCK-8、Western blot、RT-qPCR等技术对肌源性干细胞、去分化细胞和许旺细胞样细胞进行鉴定及相关分析,同时检测去分化过程和许旺细胞样细胞分化过程中环磷酸腺苷信号通路相关蛋白的表达。结果与结论:(1)细胞免疫荧光染色显示取自SD乳鼠的原代细胞能够被肌源性干细胞特异性标志物Desmin标记;(2)CCK-8结果显示第1-3代肌源性干细胞增殖活性逐渐增加,第3-8代肌源性干细胞增殖活性趋于稳定;(3)Western blot结果显示睫状神经营养因子诱导后成肌分化相关蛋白p21和MyoG表达降低,环磷酸腺苷信号通路相关蛋白p-CREB表达增加,Fsk-IBMX诱导后许旺细胞标志物S100β、GFAP和p75以及p-CREB表达均增加,而环磷酸腺苷抑制剂SQ22536可以抑制睫状神经营养因子和Fsk-IBMX的作用;(4)RT-qPCR结果与Western blot结果一致,即Fsk-IBMX诱导后S100β、GFAP和p75 mRNA表达水平增加,而SQ22536可以抑制这一效应;CCK-8结果显示Fsk-IBMX诱导后细胞活性有所降低;(5)结果显示:睫状神经营养因子复合Fsk-IBMX可以诱导肌源性干细胞分化为许旺细胞表型,并且诱导过程激活了环磷酸腺苷信号通路。

毛喉素对8-甲氧补骨脂素诱导鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶基因表达水平的调节

目的 观察蛋白激酶 A信号途径对 8－甲氧补骨脂素 (8-MOP)诱导的鼠黑素瘤细胞黑素生成及酪氨酸酶基因表达水平的影响。方法 用半定量逆转录聚合酶链反应技术检测腺苷酸环化酶特异性激活剂毛喉素对 8-MOP诱导的鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性、黑素含量以及酪氨酸酶基因表达水平的影响。结果 毛喉素与 8-MOP联合处理组所测的酪氨酸酶活性和黑素含量与空白对照组相比提高近 7或 10倍。毛喉素与 8-MOP单独处理组较空白对照组酪氨酸酶 mRNA表达水平上调百分率分别为 26.06％和 6.58％，而联合处理组上调百分率为 56.82％。结论 毛喉素在体外对 8-MOP诱导的黑素生成呈明显增强作用，这一作用与毛喉素在转录水平上调酪氨酸酶 mRNA表达促进酶蛋白合成有关。毛喉素作为治疗白癜风的一种信号转导药物，其临床应用价值有待今后进一步研究。

毛喉素在大鼠脑损伤后血脑屏障损害中的作用

目的 探讨提高细胞内cAMP制剂毛喉素在脑损伤后血脑屏障损害中的作用。方法 雄性SD大鼠60只按随机数字表分为正常对照组、假手术组、脑损伤组和毛喉素治疗组，每组15只。后2组大鼠采用改进的自由落体硬膜外撞击方法制作脑损伤模型，治疗组大鼠于伤后0．5h腹腔注射毛喉索，伤后24h处死大鼠（处死前1h静脉注射20g／L伊文氏蓝），应用荧光显微镜观察伊文氏蓝的渗出，分光光度计恻定脑组织伊文氏蓝的含量。结果 正常对照组和假手术组大鼠损伤组织周同伊文氏蓝无明显渗出，脑损伤组伊文氏蓝大量渗出，治疗组与脑损伤组比较，伊文氏蓝渗出明显减少：脑损伤组大鼠左侧皮质、海马和右侧皮质、海马伊文氏蓝含量明显高于正常对照组和似手术组，差异有统计学意义（P〈O．05）；毛喉素治疗组左侧皮质伊文氏蓝含量明显低于脑损伤组，但仍高于正常对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 提高细胞内cAMP制剂毛喉素能明显阻止血脑屏障开放。

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