拟蜘蛛牵丝蛋白基因细毛羊毛囊特异表达载体的构建及其转基因细胞株的筛选

试验旨在获得具有毛囊表达特性的转蜘蛛牵丝蛋白基因细胞株。根据GenBank上发表的棒络新妇属蜘蛛的cDNA片段合成拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体S,加倍后连入pEGFP-N1框架载体以构建真核表达载体pK-2S,转染新疆美利奴细毛羊皮肤成纤维细胞后筛选单克隆,并通过PCR在DNA、RNA水平检测阳性克隆。基因合成后测序结果显示序列正确,酶切得到正确目的条带,筛选出阳性克隆并且可以在基因组及cDNA上扩增出目的片段。本研究成功将蜘蛛牵丝蛋白基因转入新疆美利奴细毛羊细胞,并在RNA水平表达,为培育毛囊特异表达蜘蛛牵丝蛋白基因并具有更高机械性能羊毛的新型细毛羊品种奠定基础。

重组毛囊特异性表达载体的构建与验证

[目的]构建毛囊特异性表达绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9(KIF Ⅱ-9)cDNA的毛囊特异性表达载体,并证明其表达的有效性。[方法]根据绵羊毛角蛋白关联蛋白6-1(KAP6-1)基因已知DNA序列设计合成2个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到KAP6-15’调控序列,然后与毛角蛋白Ⅱ型中间丝基因(KIFII-9)cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成皮肤特异性表达载体pcDNA3.1-KK,新生小鼠皮下注射该重组载体证明其表达有效性。[结果]PCR扩增出1042 bp的特异性片段,DNA测序结果证明,该克隆片段与KAP6-1 5’端调控区序列相比具有极高的一致性;构建的毛囊特异性表达载体PCDNA3.1-KK,皮下注射新生小鼠,皮肤内KIF Ⅱ-9得到转录。[结论]该试验构建的载体PCDNA3.1-KK具有表达特异性。

陕北白绒山羊Lhx2毛囊表达载体构建及转染成纤维细胞的研究

以陕北白绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,扩增出Lhx2基因的CDS区,成功构建了以KAP6.1为启动子表达Lhx2基因的绿色荧光表达载体pIRES2-KAP-LHX-EGFP.并利用脂质体介导转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系,经PCR检测显示外源基因已整合到细胞基因中.研究结果为进一步开展Lhx2基因对绒山羊毛囊发育的影响和转Lhx2基因绒山羊的生产提供了前期研究基础.