猪脱细胞真皮基质与肿瘤坏死因子-α调控毛囊角质细胞Wnt3a/β-catenin信号通路表达的实验研究

目的:探讨猪脱细胞真皮基质(pADM)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对毛囊角质细胞Wnt3a蛋白/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路表达的影响。方法:①在小鼠背部皮肤用皮肤取样器制作8 mm全层皮肤缺损模型,用带有窗口的8 mm硅胶套环与创面皮缘缝合,分别使用纱布(纱布组)或pADM(pADM组)覆盖创面,观察创面愈合情况,并于第7、14、21天取从硅胶套环窗口处爬行的新生皮肤组织,通过免疫组化法检测皮肤组织中TNF-α、Wnt3a和β-catenin蛋白的表达水平。②在体外实验中,大鼠毛囊角质细胞分为对照组(正常培养)、pADM组、TNF-α组、TNF-α抑制剂组、TNF-α+pADM组、TNF-α抑制剂+pADM组6组,给予相应的干预措施培养48 h,免疫印迹法(Western Blot)检测各组细胞中Wnt3a、β-catenin蛋白表达量。结果:①体内实验结果显示,与纱布组比较,pADM组创面组织中的TNF-α、Wnt3a、β-catenin蛋白表达均上调,分别在第14、7、21天达峰值,各时间点之间差异均有统计学意义(P均<0.01)。②体外实验结果显示,与对照组相比,毛囊角质细胞中的Wnt3a和β-catenin蛋白水平在TNF-α组表达下调,在pADM组、TNF-α抑制剂组、TNF-α+pADM组、TNF-α抑制剂+pADM组表达上调。pADM组与TNF-α抑制剂组比较,Wnt3a和β-catenin蛋白水平差异有显著性(P均<0.01),在pADM组上调水平更高;TNF-α抑制剂组与TNF-α抑制剂+pADM组相比,两蛋白表达水平的差异具有显著性(P均<0.01),TNF-α抑制剂+pADM组上调水平更高。结论:pADM在体内能够上调TNF-α、Wnt3a和β-catenin的蛋白表达,在体外可能具有TNF-α抑制剂样作用,并能加强TNF-α抑制剂的作用。pADM具有促进全皮层缺损创面愈合的作用,并可能通过上调毛囊角质细胞中Wnt3a/β-catenin蛋白的表达促进毛囊再生。

不同浓度猪脱细胞真皮基质诱导小鼠毛囊角质细胞迁移的实验研究

目的:探讨不同浓度猪脱细胞真皮基质(pADM)对小鼠毛囊角质细胞迁移的诱导作用。方法:在Transwell实验和细胞划痕实验中,分别将0、2、10、20、40mgpADM配制成5个浓度梯度,分别作用于小鼠毛囊角质细胞。Transwell实验分组pADM浓度为0、4、20、40、80μg/μl;细胞划痕实验中pADM浓度分别为0、1、5、10、20μg/μl。每组重复3次。观察不同浓度pADM诱导毛囊角质细胞迁移的作用。结果:在Transwell实验中,0、4、20、40和80μg/μl组毛囊角质细胞计数分别为(51.67±2.96)、(129.78±2.91)、(187.11±0.84)、(159.89±2.69)和(161.44±3.4)个,差异具有统计学意义(P<0.05)。划痕实验中,0、1、5、10、20μg/μl组划痕愈合面积百分比分别为(1.8±0.3)%、(11.8±0.2)%、(32.4±0.6)%、(22.1±0.2)%和(21.8±0.2)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。划痕愈合百分比随pADM浓度增加而逐渐增大,在5μg/μl组达到高峰,随后逐渐下降,其变化趋势与Transwell实验表现一致。结论:pADM具有诱导毛囊角质细胞迁移的作用,其作用大小与pADM浓度有关。

基质细胞衍生因子-1促进毛囊角质细胞增殖的研究

目的观察基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对体外培养的大鼠毛囊角质细胞增殖的影响。方法 2019年6月至2020年1月,采用免疫荧光检测大鼠毛囊角质细胞(购自中国赛百慷生物有限公司)标志物角蛋白14(K14)的表达量。细胞计数试剂盒(CCK-8)检测0、5、10、25、50 μg/L浓度SDF-1作用大鼠毛囊角质细胞24 h后,10、25 μg/L浓度SDF-1作用大鼠毛囊角质细胞48 h后,及10、25 μg/L浓度SDF-1加入50 nmol/L趋化因子受体-4(CXCR4)拮抗剂普乐沙福(AMD3100)作用大鼠毛囊角质细胞24 h后毛囊角质细胞增殖;5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)标记法分别检测对照组(0 μg/L SDF-1),25 μg/L SDF-1组,25 μg/L SDF-1+50 nmol/L AMD3100组作用大鼠毛囊角质细胞24 h后毛囊角质细胞增殖。组间比较采用t检验。结果细胞免疫荧光显示95%以上细胞K14染色呈阳性。CCK-8检测结果显示与0 μg/L浓度SDF-1(103.04±0.99)比较5 μg/L浓度SDF-1对细胞增殖活性无明显影响(100.67±4.59,t=0.905,P>0.05),差异无统计学意义,10、25、50 μg/L浓度SDF-1促进毛囊角质细胞增殖(111.44±4.95、124.59±2.08、125.11±0.48,t10=3.221,P10<0.05;t25=8.624,P25<0.01;t50=8.464,P50<0.01),差异有统计学意义。与浓度为25 μg/L比较,SDF-1浓度为10 μg/L促增殖作用减弱(t=5.043,P<0.01),差异有统计学意义,浓度为50 μg/L促增殖作用无明显变化(t=0.199,P>0.05),差异无统计学意义。10、25 μg/L浓度的SDF-1作用48 h(98.26±5.24、112.39±2.30)与作用24 h(111.44±4.95、124.59±2.08)比较其促增殖作用减弱(t10=3.167,P10<0.05;t25=6.816,P25<0.01),差异有统计学意义。10、25 μg/L浓度SDF-1加入50 nmol/L AMD3100作用毛囊角质细胞24 h后,毛囊角质细胞增殖明显受到抑制(84.20±1.06、98.51±0.92,t10=9.325,P10<0.01;t25=19.900,P25<0.01),差异有统计学意义。EdU检测结果进一步验证SDF-1具有促进毛囊角质细胞增殖作用(SDF-1组:38.59±0.33,对照组:22.45±2.59,t=10.700,P<0.01),AMD3100可抑制SDF-1促增殖作用(22.12±1.96,t=10.700,P<0.01),差异有统计学意义。结论 SDF-1在10~50 μg/L浓度范围内对体外培养的大鼠毛囊角质细胞有促进增殖作用,且该增殖作用能被AMD3100抑制。

猪脱细胞真皮基质调控肿瘤坏死因子-α对毛囊角质形成细胞淋巴增强因子1和细胞核增殖抗原表达的作用

目的探讨猪脱细胞真皮基质(pADM)在体外培养中对毛囊角质形成细胞增殖的影响及其机制。方法体外实验培养毛囊角质形成细胞,按照干预措施不同分为6组,A组为单纯毛囊角质形成细胞组;B组为毛囊角质形成细胞+pADM组(20 mg/L);C组为毛囊角质形成细胞+肿瘤坏死因子-α(TNF-α)组(10μg/L);D组为毛囊角质形成细胞+TNF-α抑制剂组(Lenalidomide);E组为毛囊角质形成细胞+TNF-α(10μg/L)+pADM组(20 mg/L);F组为毛囊角质形成细胞+TNF-α抑制剂+pADM组(20 mg/L)。用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法分别测定各组的淋巴增强因子1(LEF-1)mRNA及细胞核增殖抗原(Ki-67)mRNA的表达。免疫荧光标记法检测B、E、F组的毛囊角质形成细胞,观察pADM对毛囊角质形成细胞增殖的影响。两组间比较采用独立样本t检验。结果A组(LEF-1,1.093±0.121,Ki-67,1.100±0.089)毛囊角质形成细胞中LEF-1 mRNA及Ki-67 mRNA的表达低于B组(LEF-1,2.973±0.234,Ki-67,2.577±0.067)和D组(LEF-1,1.867±0.045,Ki-67,1.967±0.136),但高于C组(LEF-1,0.450±0.090,Ki-67,0.490±0.026)。A组与B组、A组与C组、A组与D组之间的差异均有统计学意义(A比B,t_(LEF-1)=14.280,P<0.05;t_(Ki-67)=15.390,P<0.05;A比C,t_(LEF-1)=4.887,P<0.05;t_(Ki-67)=6.356,P<0.05;A比D,t_(LEF-1)=5.875,P<0.05;t_(Ki-67)=9.030,P<0.05);B组(LEF-1,2.973±0.234,Ki-67,2.577±0.067)毛囊角质形成细胞中LEF-1 mRNA及Ki-67 mRNA的表达高于E组(LEF-1,1.793±0.078,Ki-67,1.940±0.165),而低于F组(LEF-1,4.257±0.266,Ki-67,3.193±0.155),B组与E组,B组与F组的差异均有统计学意义(B比E,t_(LEF-1)=8.964,P<0.05;t_(Ki-67)=6.634,P<0.05;B比F,t_(LEF-1)=9.749,P<0.05;t_(Ki-67)=-6.425,P<0.05);免疫荧光结果显示,B组毛囊角质形成细胞数量高于E组而低于F组。结论在体外培养中,pADM可能通过下调TNF-α促进LEF-1和Ki-67的表达,从而促进毛囊角质形成细胞的增殖。