毛囊隆突区β神经生长因子水平对乳鼠烫伤创面愈合的影响

背景:毛囊干细胞在受到外界环境刺激作用下,例如创伤,化学伤等,其理化性质及细胞状态会有所变化。但是从目前文献来看,涉及其在皮肤烫伤中变化的研究的比较少。目的:初步观察大鼠烫伤模型中,毛囊隆突区β神经生长因子的表达变化以及对烫伤组织愈合的影响。方法:随机选取30只乳鼠,采用90℃水温持续3s时间的方式制作大鼠触须部表皮组织浅Ⅱ度烫伤模型,造模后第12,24,36,48,60小时对毛囊隆突区进行分离,并进行匀浆,以同窝新生6只乳鼠正常唇部组织作为对照。采用Brandford法进行总蛋白检测及ELISA定量检测β神经生长因子。免疫组织化学进行神经生长因子的定性半定量检测。结果与结论:在烫伤后各时间点检测的β神经生长因子与总蛋白比值中,β神经生长因子的表达在烫伤后36h开始后增高,60h达到峰值。组织切片中同样发现这一规律。通过图像软件分析表明,提取β神经生长因子蛋白检测与组织水平β神经生长因子表达一致。提示烫伤后12～60h时间段内,烫伤后60h隆突区表达的β神经生长因子达到峰值,对烫伤愈合的修复作用也达到峰值。隆突区是毛囊干细胞的巢,此部位β神经生长因子表达增强可能对毛囊干细胞的分化和组织修复具有一定的积极意义。

毛囊隆突细胞体外诱导分化的形态学观察

目的:探讨体外诱导毛囊隆突细胞向毛囊和皮脂腺上皮细胞分化潜能。方法:体外分离培养人胎儿毛囊隆突细胞,分别利用与毛乳头细胞共培养,雄激素、胰岛素和地塞米松等为诱导剂诱导,观察毛囊隆突细胞的生长特性及形态变化。结果:毛囊隆突细胞与毛乳头细胞共培养后成克隆性生长,并被毛乳头细胞围绕,随着培养时间延长,细胞出现堆积和分层,中心形成毛囊样结构;在成脂诱导剂作用下,毛囊隆突细胞体积变大,出现特异的“扇贝”形细胞,胞浆内出现大小不等脂滴,随着培养时间延长,细胞形态变为椭圆、纺锤或不规则形,部分伸展的细胞相互融合,包裹形成不规则的网格状。结论:在不同诱导条件下,毛囊隆突细胞在形态上具有向毛囊和皮脂腺上皮细胞分化的潜能。

人毛囊隆突区上皮干细胞、黑素干细胞及自发荧光存在的研究

目的·探讨人毛囊隆突区是否存在上皮干细胞、黑素干细胞及自发荧光。方法·标本收集自整形外科健康志愿者后枕部和颞部全层头皮,分离完整毛囊。利用荧光显微镜观察毛囊自发荧光情况;采用间接免疫荧光法和免疫组织化学法检测毛囊角蛋白K15和K19的表达情况;采用RT-PCR检测毛球和隆突区上皮干细胞及黑素干细胞的标志物Dct、K15和K19,以及成熟细胞标志物Tyrase、Tyrp1、MC1R、MITF的mRNA水平。结果·人毛囊隆突区细胞可观察到自发荧光;免疫荧光和免疫组织化学检测结果显示隆突区外毛根鞘表达K15和K19;RT-PCR结果显示,隆突区Dct、K15的mRNA水平显著高于毛球,K19的mRNA水平与毛球相比无显著差异,而Tyrase、Tyrp1、MITF-M、MC1R的mRNA表达水平显著低于毛球。结论·人毛囊隆突区细胞可观察到自发荧光,且有上皮干细胞与黑素干细胞的存在。

人胎儿毛囊隆突细胞的培养方法及其向皮脂腺细胞诱导分化的初步研究

目的探讨简单快捷地获得大量人毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性的方法,观察其向皮脂腺细胞分化的可行性。方法用传统的器械分离法(简称传统法)和改进的消化分离法(简称改良法)对人胎儿毛囊隆突细胞进行分离培养,比较两种方法的细胞获得效率和细胞生长特性。在对毛囊隆突细胞进行诱导培养后,行抗上皮膜抗原(EMA)抗体免疫组织化学染色,以检测细胞EMA的表达情况。噻唑蓝(MTT)法检测细胞克隆形成率。用亲和素-生物索复合物(ABC)标记法行毛囊隆突细胞角蛋白19(K19)染色。结果传统法每小时可获得8～10个毛囊隆突,贴壁48h后有细胞长出,贴壁率为40%～50%,培养14d左右传代；改良法每小时可获得毛囊隆突100个左右,接种后12h即可贴壁并有细胞长出,贴壁率30%,细胞生长迅速,7d左右即可传代。毛囊隆突细胞诱导培养7d后,细胞体积变大,随着时间延长,细胞进一步变大,细胞质中有脂滴样颗粒围绕在核的周围,细胞形状不规则。诱导培养14d后,抗EMA抗体免疫组织化学染色呈阳性表达。改良法的细胞克隆形成率为(18．2±2．1)%,明显高于传统法[(12．7±3．4)%,P＜0．05]。毛囊隆突细胞K19免疫组织化学染色呈阳性,其细胞分布满视野,细胞质内含有大量棕色颗粒。结论改良法可以获得大量毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性,在体外诱导条件下,具有向皮脂腺细胞分化的潜能。

人毛囊隆突区迁出细胞p75、MSX2、OCT4和NANOG的表达

目的检测神经嵴干细胞标记(p75、MSX2)和自我更新标记(OCT4、NANOG)在人毛囊隆突区迁出细胞的表达,并进一步检测其增殖活性。方法取正常头皮组织,显微分离单个毛囊隆突,并体外培养,观察迁出细胞的生长情况;采用免疫荧光染色法检测人毛囊隆突区迁出细胞p75、MSX2、OCT4和NANOG的表达;采用BrdU标记免疫荧光染色检测细胞增殖活性。结果p75、MSX2、OCT4和NANOG在人毛囊隆突区迁出细胞中呈阳性表达。传代培养24 h、48 h、72 h后BrdU阳性率分别为(49.50±4.62)%、(33.43±10.43)%、(17.51±8.51)%,且在传代培养24 h时增殖能力较高。结论人毛囊隆突区存在神经嵴干细胞,且该细胞具有迁移、自我更新能力及较强的增殖活性。

山羊毛囊干细胞分离、培养及鉴定

采用2.4 U/mL Dispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部,经胰酶(0.5 mg/mL胰酶+0.2 mg/mLEDTA)消化从山羊耳部皮肤分离得到毛囊干细胞,用自制无血清培养基培养,并用形态学观察、细胞生长曲线、克隆形成率及免疫组化染色检测,探讨毛囊干细胞体外分离培养方法及生物学特性。结果表明,所分离细胞具备毛囊干细胞特征:体积较小、表面光滑、立体感强,呈现未分化细胞特征;K19、integrin-β1以及p63免疫组化染色阳性;第3、5、7代干细胞克隆形成率分别为25.6%±2.6%、31.8%±1.9%和27.0%±3.9%,极显著高于对照组角质细胞克隆形成率(P<0.01)。采用配制的无血清条件培养液可使山羊毛囊干细胞体外维持未分化状态并传代至19代。

山羊毛囊干细胞的分离及体外培养

试验采用2．4U／mL Dispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部，经胰酶（0．5mg／mL胰酶＋0．2mg／mL EDTA）消化从山羊耳部皮肤分离得到的毛囊干细胞，然后进行形态学观察、细胞生长曲线测定、克隆形成率及免疫组化染色检测，并对毛囊干细胞的基础培养基进行了筛选。结果表明：DMEM／F12是一种适合毛囊干细胞体外增殖培养的培养基；在以DMEM／F12为基础培养液的培养体系中细胞可传代至19代。