球毛壳菌小麦秸秆发酵产物抑制辣椒疫霉的稳定性及机制

【目的】由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)侵染引起的疫病给辣椒等作物产业带来了巨大的经济损失。论文旨在明确球毛壳菌(Chaetomium globosum)代谢产物抑制辣椒疫霉的稳定性和抑菌机制,为研究与开发辣椒疫霉的微生物源抑菌剂提供参考。【方法】将球毛壳菌发酵粗提物分别在不同温度(40—121℃)、pH(1—13)、光照时间(0—12 d)和储存时间(0—60 d)条件下进行处理,采用菌丝生长抑制法测定经不同处理后粗提物对辣椒疫霉的抑制率,以探究粗提物抑制辣椒疫霉的热、酸碱、光和时间稳定性。利用光学显微镜观察粗提物对辣椒疫霉菌丝形态的影响,通过多种生理生化试验探究粗提物作用于辣椒疫霉12—72 h后,对辣椒疫霉细胞壁、细胞膜、活性氧代谢、蛋白质含量、还原糖含量和致病力的影响。【结果】在所设置的处理范围内,球毛壳菌发酵粗提物(1 mg·mL^(-1))经不同光照时间和储存时间处理后对辣椒疫霉的抑制率没有显著降低,抑制率维持在93%左右;粗提物在40—70℃的热处理范围内对辣椒疫霉的抑制率没有显著降低,70℃以上的热处理会显著降低粗提物对辣椒疫霉的抑制率,但抑制率不低于70%;粗提物在pH 1—5和9—13的酸碱处理范围内会显著降低对辣椒疫霉的抑制率,但抑制率也不低于70%。粗提物处理影响辣椒疫霉菌丝形态,使菌丝发生严重的扭曲皱缩现象,并影响活性氧代谢,使菌丝中的活性氧大量积累。辣椒疫霉经粗提物处理12—72 h后,其培养液中的碱性磷酸酶活性、β-葡萄糖苷酶活性、核酸和蛋白质含量均显著升高,且其菌丝中的丙二醛和过氧化氢含量显著增加。辣椒疫霉菌丝中的过氧化氢酶活性、可溶性蛋白和还原糖含量则在粗提物处理12—72 h内显著降低,而超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多聚半乳糖醛酸酶和β-葡萄糖苷酶活性则仅在一定时间显著降低。【结论】在本试验所设置的处理范围内,球毛壳菌的小麦秸秆发酵粗提物抑制辣椒疫霉的效果不受光照及储存时间的影响,但超过70℃的热处理和pH 1—5和9—13的酸碱处理会显著降低粗提物对辣椒疫霉的抑制效果。此外,该粗提物通过改变菌丝形态,破坏细胞壁和细胞膜,引发细胞内物质泄漏,降低菌丝中蛋白质和还原糖含量,抑制抗氧化酶活性,干扰活性氧代谢使活性氧大量积累从而抑制辣椒疫霉。

球毛壳菌固态发酵产抗植物病原真菌活性物质的工艺优化

【目的】优化球毛壳菌(Chaetomium globosum)秸秆固态发酵的培养基组成和发酵条件,提高发酵粗提物的抗真菌活性,为球毛壳菌生物农药的开发及秸秆绿色资源化提供参考。【方法】首先,以粗提物抗9种植物病原真菌菌丝生长的抑制率为评价指标,对培养基中的秸秆(水稻、小麦、玉米、油菜)和氮源(豆粕、麦麸、氯化铵)进行筛选,确定最适发酵培养基组成。随后进行发酵条件的单因素优化,以粗提物对辣椒疫霉的抑制率为评价指标,初步确定各发酵条件的较优范围及对粗提物抗真菌活性影响的程度。基于单因素优化的结果,利用正交设计对发酵条件进行正交优化,各参数的范围如下:发酵时间18—36 d、发酵温度26—32℃、培养基初始含水量70%—85%、秸秆与麦麸质量比4﹕1—1﹕1、秸秆粒径20—>100目。最后,获得球毛壳菌秸秆固态发酵产抗真菌活性物质的最优发酵条件并进行验证。【结果】在筛选固态发酵培养基组成时发现,球毛壳菌以小麦秸秆和麦麸组成的培养基进行发酵所获得的粗提物的抗真菌效果总体上优于其他组成的培养基。在发酵条件单因素优化中,菌液接种量对粗提物抗真菌效果影响不显著,故不对其进行后续的正交优化。正交优化中各发酵条件对球毛壳菌发酵粗提物抗真菌活性的影响极为显著(P<0.001),其影响程度依次为小麦秸秆与麦麸质量比>发酵时间>培养基初始含水量>发酵温度>小麦秸秆粒径。正交优化获得的最优发酵条件为发酵时间24 d、发酵温度26℃、培养基初始含水量80%、小麦秸秆与麦麸质量比4﹕1、小麦秸秆粒径60—100目。经发酵条件优化后,1 mg·mL^(-1)的球毛壳菌发酵粗提物对核盘菌、辣椒疫霉、稻瘟病菌、桃褐腐病菌、尖镰孢、黄色镰孢、鞘腐霉、禾谷镰孢、水稻纹枯病菌的抑制率分别为100%、92.86%、85.94%、83.90%、76.12%、73.02%、66.18%、58.96%、52.99%。【结论】经过发酵培养基组成和发酵条件优化后,球毛壳菌的发酵粗提物具有较高的抗真菌活性,可为后续分离、纯化球毛壳菌利用秸秆固态发酵产生的抗真菌活性物质打下基础。

球毛壳菌促生防病机制及应用研究进展

球毛壳菌是植物常见的内生真菌,对多种植物病害有生防作用。本文从产生抗菌活性物质、促进植物生长、诱导植物抗性、生态位和营养物质竞争和重寄生作用等方面综述了球毛壳菌对植物病害的生防作用机理。阐明球毛壳菌在植物防病促生、土壤改良和秸秆降解方面具有广阔的应用潜力。探讨了球毛壳菌规模化发酵和基因工程技术的研究进展。本研究将为促进球毛壳菌的应用研究提供理论参考。

球毛壳菌ND35对枸杞扦插苗根系发育的影响

球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35是分离筛选自健康毛白杨的优势植物内生真菌。本文通过测定球毛壳菌ND35处理的枸杞扦插苗侧根数量、根系活力、根系木质素含量和叶绿素含量等分析其对枸杞扦插苗根系生长发育的影响。研究结果表明,球毛壳菌ND35显著增加了枸杞扦插苗侧根数量,提高了扦插苗根系活力、根系木质素含量和叶绿素含量。同时,球毛壳菌ND35能够诱导苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)等木质素关键合成酶的活性提高,促进枸杞扦插苗根系的木质化。本文研究结果将为球毛壳菌ND35在枸杞繁育、栽培生产中的开发应用提供理论依据。

螺卷毛壳菌Chaetomium cochliodes对玫瑰黑斑病病原菌的影响

为了筛选抗玫瑰黑斑病的内生真菌,本研究将一株来源于玫瑰茎部的内生真菌螺卷毛壳菌Chaetomium cochliodes作为拮抗菌与玫瑰黑斑病病原菌蔷薇盘二孢(Marssonina rosae)进行对峙培养,研究拮抗菌螺卷毛壳菌是否对玫瑰黑斑病病原菌蔷薇盘二孢具有抑制作用。研究结果表明,单独培养时,随着培养时间的延长,病原菌和拮抗菌菌落直径不断增加,不同培养时间菌落直径均具有显著性差异(P < 0.01);拮抗培养时,拮抗菌随着时间的延长菌落直径仍不断增加,且不同培养时间菌落直径具有显著性差异(P < 0.01),而病原菌在拮抗培养时菌落直径无显著性差异,拮抗菌对病原菌有显著的抑制效果,在培养72 h后抑制率达到60.7%,相对抑制率达到5.38,说明螺卷毛壳菌Chaetomium cochliodes对菌蔷薇盘二孢(Marssonina rosae)具有明显的抑制作用,可以作为防治玫瑰黑斑病的潜在生防菌。该研究结果为筛选抗玫瑰黑斑病潜在生防菌及开发利用提供理论依据。

云杉内生优势毛壳菌的筛选及其生防机制研究

通过形态学和分子生物学鉴定方法,将从云杉针叶中分离得到的10株毛壳菌Chaetomium鉴定为球毛壳C.globosum、粪生毛壳C.funicola、印度毛壳C.indicum和近缘毛壳C.subaffine。通过平板生长筛选和拮抗性复筛,筛选出2株生长势高且对9种常见林木病害病原拮抗性好的优势生防菌株,分别为粪生毛壳菌株C-45和近缘毛壳菌株C-44。为了进一步了解2株优势毛壳菌的生防潜力和作用机制,对其进行了包括营养竞争、重寄生、胞外酶及代谢产物等生防机制的研究。结果显示,菌株C-45和C-44对病原菌的抑制是多种生防机制的协同作用。根据2株优势菌株在不同生防机制上表现出的差异,菌株C-44的生防作用强于菌株C-45,具有很好的生防潜力。

毛壳菌产抗真菌活性物质菌株的筛选与鉴定

对实验室分离保存的40株毛壳菌菌株代谢产物进行抗真菌活性筛选,5个菌株代谢产物对植物病原真菌具有选择性抑制效果。其中,菌株CH08、CH23发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽菌、小麦根腐菌有较强的抑制作用;菌株CH16、CH17发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽病具有较强的抑制作用;菌株CH21发酵液对西瓜枯萎菌、辣椒炭疽菌有较强的抑制作用。经形态学鉴定,CH08、CH16、CH17、CH23为球毛壳菌,CH21为角毛壳菌。

中国毛壳菌科研究Ⅰ. ——毛壳菌属的种(英文)

报道了毛壳菌属的十一个种,旋丝毛壳 Chaetomium bostrychodes,反卷毛壳 C. convolutum,舟形毛壳 C. cymbiforme,高大毛壳 C. elatum,粪生毛壳 C. funicola,球孢毛壳 C. globosporum,球毛壳 C. globosum,细丽毛壳 C. gracile,六孢毛壳 C. hexagonosporum,印度毛壳 C. indicum和近缘毛壳C. subaffine。其中包括四个中国新记录种:舟形毛壳 C. cymbiforme,球孢毛壳 C. globosporum,六孢毛壳 C. hexagonosporum和近缘毛壳 C. subaffine。根据我国的标本和菌种对新记录种作了描述,并附了显微照片。标本与菌种保存在西北农林科技大学真菌标本室 (HMUABO)。

两种毛壳菌对几种植物病原菌的生防效果分析

将角毛壳菌和球毛壳菌与立枯丝核菌等5种植物病原菌进行对峙试验,结果表明,球毛壳菌和角毛壳菌对几种病原菌的抑制作用明显.球毛壳菌主要通过竞争作用、重寄生作用抑制病原菌,角毛壳菌主要通过产生红色拮抗物质、竞争作用抑制病原菌的生长.

柑橘源球毛壳菌对番茄枯萎病的生防机制及抑菌效果

通过分子生物学鉴定方法,将从柑橘炭疽病感染叶中分离得到的1株真菌菌株5号初步鉴定为球毛壳菌(Chaetomium globsum)。通过皿内拮抗性试验和竞争试验,发现该菌株对番茄枯萎病拮抗系数为Ⅲ级,拮抗率达53.8%。为了进一步了解菌株5号球毛壳菌的生防潜力和作用机制,对其进行了包括营养竞争、代谢产物等生防机制的研究。结果显示,菌株5号对番茄枯萎病的抑制是多种生防机制的协同作用,具有一定的生防潜力。

以抗生素抗性为选择标记的毛壳菌种间原生质体融合

以抗生素抗性为选择标记进行角毛壳菌和球毛壳菌种间原生质体融合。角毛壳菌CH21－I－402菌株对潮霉素有抗性、对G418敏感，球毛壳菌CH08对潮霉素和G418敏感。根癌农杆菌介导的新霉素磷酸转移酶基因转化球毛壳菌，得到成功转化新霉素磷酸转移酶基因的球毛壳菌菌株，转化子对G418抗性提高3～4倍，对潮霉素仍然比较敏感。以耐潮霉素、不耐G418的角毛壳菌和不耐潮霉素、耐G418的球毛壳菌为出发菌株，以PEG6000为助融剂进行原生质体融合，用G418和潮霉素抗性进行筛选，获得再生菌株。经AFLP分析表明：再生菌株PF1、PF26为融合菌株，融合菌株菌落形态均与亲本存在明显差异。

绿色木霉内切几丁质酶基因的克隆及其毛壳菌转化

利用PCR方法从Trichoderma viride的基因组DNA中克隆了一个42kDa的内切几丁质酶基因,扩增的长度为1672bp,其中包含了启动子和mRNA的编码区。将该基因与来自构巢曲霉的色氨酸启动子相连后,通过原生质体转化将该基因导入球壳毛壳菌CG10。内切几丁质酶活性的测定结果表明,约1/3转化子的内切几丁质酶活性得到了明显提高。本实验为利用基因工程方法提高毛壳菌的生防能力打下了较好的基础。

嗜热毛壳菌纤维素酶(CBHⅡ)cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilumCT2是一种土壤腐生菌,可产生具有重要工业生产价值的纤维素酶类。RACEPCR获得嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHⅡ)的编码基因(cbh2)。DNA序列分析表明cbh2的开放阅读框由1428个碱基组成,编码476个氨基酸。推断的氨基酸序列包含一个典型真菌纤维素酶的糖结合域(CBD)、催化域(CD)以及二者之间富含脯氨酸和羟基氨基酸的连接桥。根据氨基酸序列推算该酶分子量为53kD,属于糖苷水解酶第六家族,具有该家族催化保守区的典型特征。PCR扩增cbh2的成熟蛋白编码基因,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达纤维二糖水解酶蛋白的重组表达载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,小规模发酵量达1.2mgmL。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fastflow阴离子层析等步骤纯化了该重组表达蛋白。SDSPAGE得到重组蛋白分子量为67kD,与从嗜热毛壳菌中纯化的该酶分子量一致。该重组纤维二糖水解酶作用的最适合温度50℃,最适pH4.0,在70℃的半衰期为30min,具有较好的热稳定性。

一株粪生毛壳菌的分离鉴定及其对辣椒枯萎病的防治效果

本文采用平板对峙法和抑菌圈法从76株粪生真菌中筛选出1株辣椒枯萎病生防菌株LJ-S2L1,并利用菌落直径法、纸片扩散法、室内毒力测定和盆栽试验评价了其防病效果。结果表明,菌株LJ-S2L1对辣椒枯萎病菌抑菌率达71.67%,可使辣椒枯萎病菌菌丝发生隘缩或断裂,抑菌圈直径达32 mm;菌株LJ-S2L1发酵液和无菌发酵滤液均对辣椒枯萎病菌菌丝生长有抑制作用,抑制率分别达61.57%和56.48%。毒力测定结果表明,菌株LJ-S2L1发酵液对辣椒枯萎病菌的抑制率在1000μL/m L时达到72.10%,抑制中浓度为300.63μL/m L;盆栽试验防治效果达到71.8%。根据形态学特征结合其分子系统发育树分析,将菌株LJ-S2L1鉴定为球毛壳菌Chaetomium globosum。

杜仲内生球毛壳菌发酵产物体外抗脂质过氧化和保护红细胞的研究

对所筛选的一株具有较高抗氧化活性的杜仲内生球毛壳菌的发酵液提取物进行体外抗脂质过氧化和抑制小鼠红细胞溶血氧化的研究。结果表明:杜仲内生球毛壳菌的发酵液提取物对小鼠肝、肾、心和脾组织的脂质过氧化的抑制效果随着发酵提取物浓度的增加而不断增强,1mg/ml发酵提取物对小鼠心和脾两种组织脂质自发过氧化的抑制率分别为71.55%和71.68%,对H2O2诱导的肝组织脂质过氧化的抑制率达到92.50%;0.3mg/ml的发酵提取物对小鼠红细胞自氧化溶血的抑制率为68.48%,对H2O2诱导的小鼠红细胞氧化溶血的抑制效果则随着浓度的提高而增强,0.75mg/ml浓度的抑制率达到96.12%。结论:杜仲内生球毛壳菌发酵液提取物在体外有较显著的抗脂质过氧化作用和通过降低氧化溶血而保护红细胞的作用。

林下参内生球毛壳菌FS-01对人参病原真菌的抑制作用

为探究林下参内生真菌球毛壳菌(Chaetomium globosum)FS-01菌株对人参病原菌的抑菌作用,该研究在实验室条件下,测定了FS-01菌株菌丝、发酵液和孢子悬浮液对人参黑斑病菌(Alternaria panax)、人参菌核病菌(Sclerotinia schinseng)、人参灰霉病菌(Botrytis cinerea)、人参立枯病菌(Rhizoctonia solani)、人参根腐病菌(Fusarium solani)5种人参病原菌的抑制作用。结果表明:内生真菌球毛壳菌FS-01对5种病原菌均有抑制作用,其中,对人参黑斑病菌的抑制作用最高,为30.80%,其次是人参立枯病菌、人参菌核病菌、人参根腐病菌和人参灰霉病菌;发酵液抑菌实验结果表明,在加入内生真菌球毛壳菌FS-01菌株发酵液的PDA培养基上,对人参灰霉病菌的抑制作用最高,为82.09%,其次是人参菌核病菌、人参黑斑病菌、人参立枯病菌和人参根腐病菌;孢子抑菌实验结果表明,在加入内生真菌球毛壳菌FS-01菌株孢子悬浮液的PDA培养基上,对人参黑斑病菌的抑制作用最高,为83.72%,其次是人参灰霉病菌、人参立枯病菌、人参菌核病菌和人参根腐病菌。综上结果认为,内生真菌球毛壳菌FS-01菌株对人参病原菌均有很高的抑菌作用,可作为人参病原菌的生防菌株资源。

木霉菌和毛壳菌对板栗疫病的抗生作用

哈茨木霉Trichoderma harzianumT88菌株、深绿木霉T.atrovorideT95菌株和螺旋毛壳Chaetomium spiraleND35菌株与板栗疫病菌Cryphonectria parasiticaLY菌株的平板对峙培养结果表明,木霉菌对营养和空间有强烈的竞争作用,表现在可使病原菌菌丝消解,对病菌菌丝的生长有明显的抑制作用;毛壳菌生长速度较慢,但可形成抑菌带,使病菌不扩展。室内水培枝条接种试验结果表明,接种拮抗菌的拮抗效果好,而且先接种拮抗菌后接种病原菌的处理比拮抗菌和病原菌同时接种的处理效果还好,毛壳菌没有木霉菌的作用明显。接种枝条的木霉菌、毛壳菌和病原菌的再分离结果表明,T95和ND35的定殖能力强。

油菜内生球毛壳菌抑菌作用初步测定

平板对峙试验显示,从油菜(Brassicanapus)叶、根和种子上分离到的14株内生球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)对油菜菌核病原菌和立枯丝核菌均有不同程度的抑制作用,其中以种子上分离到的Dyst-1和MYNS-1的抑制作用最好。Dyst-1和MYNS-1的发酵液通过高压湿热灭菌和细菌过滤器过滤灭菌后,分别对所选用的几株植物病原真菌表现出抑制作用,特别是对油菜种传病害菌核病病菌。油菜内生球毛壳菌的详细抑菌机制需进一步研究。

嗜热毛壳菌内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

探讨了液体发酵嗜热毛壳菌 (Chaetomiumthermophile)产生的内切 β 葡聚糖酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE SepharoseFastFlow阴离子层析、Pheny1 Sepha rose疏水层析、Sephacry1S 1 0 0分子筛层析等步骤便可获得凝胶电泳均一的内切 β 葡聚糖酶。经 1 2 5 %SDS PAGE和凝胶过滤层析法分别测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为 6 7 8kD和6 9 8kD。该酶反应的最适温度和pH分别为 6 0℃和 4 0～ 4 5在pH5 0条件下 ,该酶在 6 0℃下稳定 ;70℃保温 1h后 ,仍保留 3 0 %的活性 ;在 80℃的半衰期为 2 5min。金属离子对内切β 葡聚糖酶的活性影响较大 ,其中Na+ 对酶有激活作用 ;Fe2 + 、Ag+ 、Cu2 + 、Ba2 + 、Zn2 + 等对酶有抑制作用。该酶对结晶纤维素没有水解能力。

球毛壳菌CIB-160次生代谢产物的分离鉴定及其免疫活性

采用硅胶柱层析、HPLC、Sephadex LH-20凝胶柱层析等分离方法对球毛壳菌CIB-160的次生代谢产物进行纯化,得到10个化合物。通过NMR、HR-MS和旋光数据分析以及文献比对,其结构鉴定为chaetoglobosins A（1）、C（2）、E（3）、F（5）、Fex（6）、W（7）,penochalasin F（4）,5-（methyl-2-butenyl）-indole-2,3-dione（8）、chaetoviridin A（9）和cochliodone A（10）。8和10为首次从野生型球毛壳菌代谢物中分离得到的化合物。体外免疫活性检测显示1-6对小鼠脾细胞的增殖具有抑制作用,IC50值分别为0.21、2.8、2.3、2.2、1.7、2.7μM。同时1-6具有较强的细胞毒性,对静息小鼠脾细胞存活率IC50值分别0.82、7.5、2.3、6.1、4.6、6.7μM。