侵袭性毛孢子菌感染的诊断和治疗

侵袭性毛孢子菌感染主要包括真菌血症、单个器官感染和播散性毛孢子菌病,常发生于免疫低下人群,尤其因患有血液病或化疗而出现中性粒细胞减少的患者,诊断需结合临床表现、组织病理活检和血培养等。由于毛孢子菌属种间鉴定的困难和标准化体外药敏试验的缺乏,毛孢子菌病的最佳治疗方案尚未确定,应根据体外药敏试验制定个体化治疗方案。

念珠菌显色培养基用于阿萨希毛孢子菌鉴定

阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii,T.asahii）为酵母样真菌。国外报道多见于血液病、恶性肿瘤、免疫缺陷、白细胞减少症等患者的皮肤感染。2001年杨蓉娅报道了国内首例T.asahii所致的全身性感染病例。2009年1月～8月笔者从7968份肾移植、糖尿病、肾病、高位截瘫、天疱疮患者的尿液、痰液和分泌物标本中分离出8株T.asahii并对其进行了显色和生化鉴定的研究,现报道如下。

DC-SIGN基因在阿萨希毛孢子菌小鼠皮肤感染时的表达与调控

目的了解树突细胞C型凝集素(DC-SIGN)是否参与了皮肤毛孢子菌感染过程中的免疫应答。方法25只BALB/C小鼠备皮后皮下接种3.2×107cfu/ml的阿萨希毛孢子菌悬液,分别于接种后1、3、7、14d处死小鼠,切取皮损,RT-PCR检测皮肤毛孢子菌感染过程中DC-SIGN mRNA的表达,基因芯片技术观察免疫相关基因的改变。结果皮下接种后3、7、14d接种侧皮肤组织标本可扩增出DC-SIGN目的片段,而未接种侧皮肤组织标本均未扩增出DC-SIGN目的片段。补体C2、前列腺素EP4受体、肿瘤坏死因子诱导蛋白cg12-1(CG12-1)、干扰素诱导蛋白(Ifit3)、淋巴细胞抗原6复合物、CD53抗原、CD22抗原等下调。结论DC-SIGN参与了皮肤毛孢子菌的感染过程,它不仅抑制Th1型细胞免疫,而且可抑制前列腺素EP4受体及部分补体因子等,从而导致皮肤毛孢子菌感染的慢性化。

rRNA基因序列分析在阿萨希毛孢子菌鉴定中的应用

作者对近年有关毛孢子菌属rRNA分析的研究进行了综述,目前的研究结果表明rRNA的26S亚基的D1/D2区、ITS和IGS区的序列分析对毛孢子菌属的鉴定均有一定价值,其中ITS转录间区与18S、5.8S以及26S相比具有较高的特异性;IGS区序列分析优于ITS区序列分析;IGS1区优于IGS2区。

阿萨希毛孢子菌非系统播散性感染16例临床特点及诊治观察

目的阿萨希毛孢子菌非系统播散性医院感染情况并药敏分析。方法对4年来河北医科大学第二医院住院患者标本中分离出的16例阿萨希毛孢子菌的病例资料进行回顾性调查,并采用生物梅里埃ATB Fungus-3进行药敏实验。以期对该菌引起感染的危险因素及抗真菌药物治疗方案进行探索及评估。结果 4年间共检出16株阿萨希毛孢子菌,检出率有逐年上升趋势。年龄以80岁以上为主,16例患者有13例采用呼吸机、导尿管等介入治疗。药敏实验及临床疗效证实两性霉素B显有良好的抗阿萨希毛孢子菌活性,其他抗真菌药物的疗效尚有争议。结论播散性感染外的阿萨希毛孢子菌感染有逐年上升趋势,对其感染的认识及抗真菌药物治疗应引起临床医生的高度重视。

阿萨希毛孢子菌生物膜形成研究

目的 观察阿萨希毛孢子菌（T.asahii）生物膜形态特征、活性分布.方法 用倒置显微镜和扫描电镜观察T.asahii生物膜的形态特征,2,3-二（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-5[（苯胺基）羧基]-2氢-氢氧化四氮唑（XTT）法和活菌计数法测定生物膜活性作定量分析,双荧光染色结合激光共聚焦显微镜观察生物膜不同层面活菌分布、活性及生物膜厚度.结果 T.asahii在聚苯乙烯表面形成生物膜,该膜扫描电镜下呈复杂的三维立体结构,包括孢子、假菌丝和真菌丝.随时间延长,其活性不断升高,XTT法和活菌计数结果一致（r=0.94,P＜0.01）,激光共聚焦显微镜下显示T.asahii生物膜不同层面的活性曲线坡度缓和,无明显规律.生物膜的厚度为14.3～31 μm.结论 体外形成的T.asahii生物膜比其浮游状态下具有更加复杂的结构,生物膜不同层面菌活性无明显差异.

阿萨希丝孢酵母引起播散性毛孢子菌病国内首例报告

目的报道国内首见阿萨希丝孢酵母(T.Asahii)所致播散性毛孢子菌病1例。方法全面临床检查排除其他疾病;多部位皮损组织及肝穿组织活检,组织病理检查;皮损组织、口腔假膜、阴道及鼻腔分泌物、尿、粪、肝穿组织及皮损表面痂皮多次真菌培养、直接镜检证实为系统性真菌病;菌种与标准菌株对照进行培养、生化试验、菌种鉴定及DNA序列分析;临床系统抗真菌治疗观察。结果发现皮肤、肝、肾、肠道、口腔、阴道粘膜等广泛受累,组织病理发现在感染性肉芽肿损害中有大量真菌孢子。真菌学培养均为同一菌落生长。菌落呈乳白色至淡黄色,表面褶皱,暗淡,边缘有菌丝长出。镜下见大小不一的矩形关节孢子及大量圆形或卵圆形孢子,出芽或不出芽,并见分支分隔菌丝。菌种经生化试验、糖发酵试验、同化硝酸盐试验、温度试验及碳源同化试验等最终鉴定为阿萨希丝孢酵母(No.AS2.2174),DNA序列分析证实该菌与阿萨希丝孢酵母的模式菌株在核糖体D1/D2区域碱基序列完全相同。经脂质体两性霉素B联合氟康唑治疗5个月后病情显著好转,各种真菌学检查阴性。结论阿萨希丝孢酵母所致播散性毛孢子菌病为国内首见;阿萨希丝孢酵母所致皮肤、粘膜、肝、脾、肾、肠道等系统损害,范围广、病程长,且基础病变不明,实为罕见。

播散性阿萨希毛孢子菌病一例

目的报道1例阿萨希毛孢子菌血症播散性消化系统及皮肤感染，探讨诊断和治疗方法。方法分析2年多的病史及其就诊的多家医院诊治资料。反复取多个部位溃疡坏死组织分别做组织病理检查，真菌学检查，取血、尿、粪行真菌培养，并作体外药物敏感试验，将培养菌落作rDNAITS序列测定。作腹部B超、肝胆核磁共振及逆行胰胆管造影（ERCP）等检查。及时联合应用足量的抗真菌药物系统治疗和局部治疗。结果病理检查发现坏死组织内大量成团孢子、少许菌丝、关节孢子及芽生孢子。坏死组织压片镜下发现大量菌丝、桶状关节孢子、芽生孢子。血液和多处溃疡组织培养均为阿萨希毛孢子菌生长。测序结果为阿萨希毛孢子菌。溃疡坏死组织及十二指肠乳头部炎性肉芽组织内均有菌丝、关节孢子。影像学检查及肝胆核磁共振及逆行胰胆管造影检查发现肝内外胆管炎、慢性胰腺炎、十二指肠乳头炎。确诊为阿萨希毛孢子菌血症——播散性毛孢子菌病。予两性霉素B和氟康唑联合治疗，后改为伊曲康唑治疗取得理想疗效。结论在诊断复杂的疑难病例时，特别是在按结核、结节病等久治无效反而加重时，应及时考虑深部真菌病。抗真菌药物应早期足量，随病情好转后渐渐减量，直至各部位炎症痊愈时才停药。

IGS1、ITS和D1／D2区在毛孢子菌鉴定中的意义及国内阿萨希毛孢子菌基因分型研究

目的比较不同DNA区域在毛孢子菌分子学鉴定方面的灵敏性和特异性以及国内临床分离5株阿萨希毛孢子菌（rasahii）基因型的研究。方法用玻璃珠法提取总DNA，用DI／D2（26S）、ITS、IGS1区的特异性引物进行PCR扩增，克隆、测序；用CLUSTAL X1．83进行比对分析，构建系统发生树并进行基因分型。结果T.asahii（CBS2479）、真皮毛孢子菌（T.dermatis）、赖巴克斯毛孢子菌（T.laibachii）3株菌D1／D2长度分别为：640、639、637bp；ITS区长度分别为：541、528、531bp；IGS1区长度分别为：643、515、411bp。临床分离5株rasahii IGS1区长度均为643bp。所有毛孢子菌D1／D2区序列相似性为：89％-99％，ITS区为85％-99％，IGS1区为11％～95％。临床分离菌株BZP07001，BZP07002，BZP07004，BZP07005属于基因型Ⅰ，菌株BZP07003属于基因型Ⅳ。结论在鉴别系统发生关系较近的毛孢子菌时IGS1区序列分析优于DI／D2、ITS区，IGS1区序列分析具有更高的灵敏性和特异性。国内临床分离5株zasahii分属基因型Ⅰ和Ⅳ。

临床分离阿萨希毛孢子菌IGS1区克隆及RFLP分析

目的明确临床分离的5株阿萨希毛孢子菌（rasahii）基因间隔区（IGS1）的序列，分析rasahfi种内基因多态性。方法用玻璃珠法分别提取临床分离5株rasahi及标准对照株总DNA，用ITS及IGS1区特异引物，PCR扩增目的区域，IGS1区扩增产物纯化后进行克隆、测序，测序结果分别提交到基因库，获取登录号。用BLAST和CLUSTALX1．83软件对序列进行比对分析。分别用限制性内切酶HapⅡ、MboI、AluI、HhaI对ITS及IGS1区PCR产物进行酶切及RFLP分析。结果6株菌均成功扩增出长度约为540bp的ITS区及643bp的IGS1区基因片段，IGS1区序列相似性为97％～99％。RFLP分析发现，菌株BZP07003IGS1区HapⅡ酶切结果及菌株BZP07004IGSl区HhaI酶切结果与其他菌株不同，MboI及AluI酶切6株菌结果无差异，ITS区6株菌酶切结果无差异。结论rasahiiIGS1区种内存在差异。HhaI及HapⅡ可用于rasahii种内多态性的分析研究，临床分离5株菌存在3种酶切结果，初步提示rasahii临床分离株可能具有种内多态性及遗传差异。

rDNA—RFLP多酶切技术用于人类致病相关毛孢子菌种问鉴定初探

目的 探讨rDNA-ITS/IGS1-RFLP多酶切技术构建毛孢子菌的酶切谱系并进行聚类分析,尝试将该方法用于人类致病相关毛孢子菌的快速种间鉴定.方法 收集8种14株毛孢子菌,对其进行rDNA-ITS/IGS1扩增测序,并分别应用HaeⅢ、Hha Ⅰ、HaeⅢ和Hha Ⅰ双酶、HinfⅠ、Msp Ⅰ和Taq Ⅰ对扩增片段进行RFLP酶切.结果 rDNA-ITS-RFLP多酶切可将8种毛孢子菌分为不同进化分支的4个亚类,而rDNA-IGS1-RFLP多酶切则可实现8种14株毛孢子菌准确的种间鉴定,并实现对部分进化距离较远的阿萨希毛孢子菌基因型之间的区分.结论 rDNA-ITS/IGS1-RFLP多酶切技术有望用于毛孢子菌属种水平的快速鉴定.

干扰素γ对小鼠巨噬细胞株RAW264．7吞噬、杀伤阿萨希毛孢子菌的影响

目的研究干扰素1对小鼠巨噬细胞株RAW264．7吞噬、杀伤阿萨希毛孢子菌（zasahii）的作用，探讨干扰素γ临床治疗zasahff感染的可能性。方法不同浓度（10、100、1000u/ml）干扰素1与RAW264．7细胞共孵育18h后，分别与zasahff临床株共培养45min、4h，以不加干扰素γ组为对照组。45min后在显微镜下观察RAW264．7细胞吞噬zasahff的情况，计数吞噬个数及计算吞噬率。4h后检测RAW264．7细胞的杀伤活性，即检测zasahfi的菌落形成单位（cfu／m1），计算生长抑制率。采用SPSS16．0软件进行统计学分析，作方差齐性检验后，用单因素方差分析（ANOVA）中的Bonferroni法进行各组均数间的两两比较。结果10、100、1000U／ml干扰素1组小鼠巨噬细胞株RAW264．7吞噬zasahfi的个数分别为25．12±1．81、35．88±3．56、52．12±3．23，吞噬率依次为25．12％、35．88％、52．12％，与对照组吞噬Zasahfi的个数（13．62±2．39）比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）；RAW264．7细胞对zasahii的杀伤活性分别为（58，62±4．89）x500、（45．50±3．02）×500、（34．62±4．24）X500cfu／ml，生长抑制率依次为25．21％、41．95％、55．83％，RAW264．7细胞的杀伤活性与对照组（68．12±3．39）×500cfu／ml比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论干扰素γ呈剂量依赖性增强小鼠巨噬细胞株RAW264．7吞噬、杀伤zasahii的作用。

国内首见真皮毛孢子菌引起皮肤感染一例

目的 报道1例真皮毛孢子菌引起的皮肤感染.方法 取皮损作直接镜检、真菌培养和组织病理学检查,分离菌株行DNA序列分析、API 20C AUX试剂盒检测、明胶液化试验、温度试验和体外药敏试验.结果 70岁男性患者,右内踝植物刺伤后出现肿块、溃疡9个月.皮损直接镜检阴性,组织病理显示真皮内菌丝和孢子.沙氏葡萄糖琼脂培养基培养出奶黄色酵母样菌落,微量培养可见假菌丝、真菌丝、关节孢子和芽生孢子,API 20C AUX试剂盒检测结果提示为土生念珠菌,DNA序列分析属于真皮毛孢子菌.菌株不能液化明胶,可在25～40 ℃环境下生长,对两性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、制霉菌素敏感.伊曲康唑治疗4个月后皮损完全愈合.结论 根据其形态学特点和DNA序列分析,菌株被鉴定为真皮毛孢子菌.伊曲康唑治疗有效.

阿萨希毛孢子菌感染的临床和药物敏感性分析

阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii）系毛孢子菌属中的一种，为酵母样真菌，是皮肤、呼吸道和胃肠道免疫受损患者和新生儿的条件致病菌，可有皮肤感染、肺部感染和播散性感染。近10余年来，有关阿萨希毛孢子菌的报道有所增多，我们在2008—2009年共发现8例阿萨希毛孢子菌感染，现报道如下。

临床相关毛孢子菌生物学特性的研究

目的了解临床常见毛孢子菌的生物学特征,为临床鉴定菌种以及诊治疾病提供依据。方法对临床分离的毛孢子菌以及已知的标准菌株进行形态学以及生理学的分类鉴定;扩增rDNA基因内转录间隔区(ITS1区以及ITS2区),序列测定,鉴定菌种;测定常见抗真菌药物对毛孢子菌的最低抑菌浓度,了解毛孢子菌对药物的敏感性。结果16株菌中的6株最终鉴定为阿萨希毛孢子,其余皮瘤毛孢子、皮毛孢子、真皮毛孢子各1株,头状地霉菌5株,另有2株无法鉴定到种。药物敏感性试验结果显示,大部分受试菌株,包括阿萨希毛孢子菌、头状地霉菌、皮毛孢子菌以及皮瘤毛孢子标准株对于伊曲康唑、特比萘芬及两性霉素B均不敏感。结论临床毛孢子菌株以阿萨希毛孢子最为常见。形态学是区别毛孢子菌属的基础;对于临床实验室而言,rDNAITS区序列测定是一种较好的鉴定方法。临床上治疗严重深部毛孢子菌感染患者时,最好采用大剂量联合治疗方案,尤其是联合使用不同作用机制的抗真菌药物,有利于提高患者免疫力。

阴道定植因肯毛孢子菌的分离鉴定

目的报道1例因肯毛孢子菌（Trichosporon inkin）的阴道定植病例并对该菌进行临床实验研究。方法患者女，34岁，阴道分泌物增多伴异味2个月就诊。对其进行临床实验室检查，并对分离菌株进行纯化、玻片小培养鉴定、温度试验、脲酶试验、生化鉴定、体外药敏试验和分子测序基因鉴定等实验研究。结果患者妇科体检阴道内可见乳白色均质化分泌物附着于阴道壁黏膜，阴道分泌物Nugent评分5～6分。两次阴道分泌物培养均分离出淡黄色有皱褶酵母样菌落。该菌在42℃可生长，玻片玉米琼脂小培养见菌丝顶端附着胞形成及典型八叠球菌样结构，最佳生长培养基为酵母菌形态琼脂培养基，脲酶试验阳性，API 20C AUX和分子测序鉴定为因肯毛孢子菌；该菌对两性霉素B和克霉唑、氟康唑等唑类药物敏感，对氟胞嘧啶和卡泊芬净耐药。结论国内首次发现毛孢子菌在阴道内定植，其准确鉴定有赖于表型特征、生化反应及分子测序的综合分析。

糖尿病患者甲真菌病临床分型菌种鉴定及与糖化血红蛋白相关性分析

甲病是皮肤科常见疾病,其中约有50%是由甲真菌病引起的,而甲真菌病的发病率高达12%,并且随着年龄的增加而发病率增加。糖尿病患者发生甲真菌病的概率较非糖尿病人群高3倍,尤其是血糖控制不佳者,由于机体组织长期处于高血糖环境,加上常有包括血管和神经病变等各种慢性并发症,容易合并各种感染,甲真菌感染则是发展成糖尿病足的重要环节。

播散性毛孢子菌病误诊1例分析

我们于2008年曾报告过“播散性阿萨希毛孢予菌病1例”E“。该例被十一家医院误诊2a多。近年来临床上仍可见类似的误诊。为了提高对深部真菌病疑难复杂病例的诊断水平，有必要对该例长期多次被误诊的原因进行认真地分析如下。