毛柳苷在脑缺血再灌注后抑制神经元自噬及神经保护作用研究

目的通过动物模型和体外细胞培养探索毛柳苷(salidroside,SAL)对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其可能机制。方法36只雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(12只)、溶剂组(12只)和SAL组(12只)。线栓法制作小鼠右侧大脑中动脉闭塞模型,缺血1 h后再灌注,而后即刻尾静脉注射150μL SAL(剂量10 mg/kg,每只实际用量0.22 mg),溶剂组注射同等体积磷酸盐缓冲液,假手术组不给药。缺血再灌注后24 h进行小鼠神经功能缺损评分,神经元特异核蛋白(neuronal nuclei,NeuN)染色统计脑梗死率。取溶剂组小鼠全脑冰冻切片,自噬标记物微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3 beta,LC3B)分别与NeuN、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光共染,观察LC3B与梗死周边区神经元、星形胶质细胞共定位情况,以明确缺血再灌注后24 h产生自噬活动的主要部位。自噬标记物苄氯素1(Beclin-1)、自噬相关蛋白3(autophagy related protein 3,Atg3)分别与NeuN免疫荧光共染,进一步观察梗死周边区神经元自噬水平变化情况,并统计Beclin-1^(+)/NeuN^(+)、Atg3^(+)/NeuN^(+)细胞在单位面积(1 mm^(2))内的个数。原代大鼠神经元培养10 d后进行氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD),将细胞分为以下6组:对照(control,CON)组、OGD 1 h后复氧1 h(OGD 1 h)组、OGD 1 h后复氧4 h(OGD 4 h)组、SAL组、OGD 1 h后复氧1 h/全程SAL治疗(OGD^(+)SAL 1 h)组、OGD 1 h后复氧4 h/全程SAL治疗(OGD^(+)SAL 4 h)组,CON组和SAL组不进行OGD,SAL剂量50μmol/L。采用免疫印迹法检测各组细胞中自噬标记物LC3B、Beclin-1、Atg3、Atg5和Atg7的相对表达量;CON组、OGD 4 h组细胞进行LC3B、NeuN免疫荧光共染,观察OGD后神经元内LC3B表达变化情况,并统计LC3B^(+)/NeuN^(+)细胞在单位面积(1 mm^(2))内的个数。结果缺血再灌注后24 h,SAL组小鼠神经功能缺损评分(5.8±1.4分vs.7.1±1.4分,P=0.0332)和脑梗死率(28.7%±9.7%vs.39.9%±9.4%,P=0.0038)均低于溶剂组。溶剂组LC3B与梗死周边区神经元有共定位,与星形胶质细胞无共定位。SAL组Beclin-1^(+)/NeuN^(+)(312.4±45.6个/平方毫米vs.471.2±50.3个/平方毫米,P=0.0121)、Atg3^(+)/NeuN^(+)(322.5±26.5个/平方毫米vs.491.3±42.1个/平方毫米,P=0.0013)细胞数量少于溶剂组。大鼠原代神经元免疫印迹结果显示,OGD 1 h组(1.096±0.004 vs.1.000±0.000,P=0.0174)、OGD 4 h组(1.213±0.019 vs.1.000±0.000,P<0.0001)LC3B相对表达量高于CON组;OGD^(+)SAL 4 h组LC3B、Beclin-1、Atg3相对表达量低于OGD 4 h组(0.833±0.029 vs.1.213±0.019,P<0.0001,0.579±0.081 vs.1.152±0.144,P<0.0001,0.726±0.182 vs.1.091±0.177,P=0.0211);OGD^(+)SAL 4 h组LC3B、Beclin-1相对表达量低于OGD^(+)SAL 1 h组(0.833±0.029 vs.1.046±0.063,P<0.0001;0.579±0.081 vs.0.921±0.09,P=0.0030)。CON组LC3B^(+)/NeuN^(+)细胞数少于OGD 4 h组(51.9±18.7个/平方毫米vs.584.2±34.5个/平方毫米,P=0.0002)。结论SAL可能通过抑制神经元自噬在急性脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用。

毛柳苷在缺血性脑损伤中对白介素4诱导蛋白1表达和小胶质细胞激活及表型的影响

目的探讨毛柳苷在缺血性脑损伤后对白介素4诱导蛋白1(interleukin-4 induced protein 1,IL4I1)表达及小胶质细胞极化的影响。方法38只雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(4只)、毛柳苷组(17只)和生理盐水组(17只)。通过线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注模型(缺血60 min拔栓实现再灌注),再灌注10 min后,毛柳苷组与生理盐水组小鼠分别经尾静脉按照10 mg/kg剂量注射毛柳苷(1 mg/mL)与生理盐水,每天1次,持续28 d。ELISA法检测假手术组及模型组缺血再灌注后48 h、7 d、28 d血清中的IL4I1浓度。采用神经元特异核蛋白(neuronalnuclei,NeuN)抗体免疫荧光染色标记神经元,观察缺血再灌注后7 d脑梗死体积。采用CD16/32、CD206和离子化钙结合适配分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)免疫荧光染色观察缺血再灌注后7 d小胶质细胞极化状态及突起的长度、数量变化。通过细胞实验探究IL4I1与小胶质细胞不同表型之间的联系。培养小鼠BV2小胶质细胞,设置M0型细胞为空白对照组,使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和INF-γ诱导BV2细胞极化为M1促炎型,使用IL-4和IL-13诱导BV2细胞极化为M2抗炎型细胞。BV2细胞诱导48 h后提取细胞蛋白,通过免疫印迹检测BV2细胞不同表型中IL4I1的表达情况。结果与假手术组相比,生理盐水组脑缺血再灌注后48 h血清中IL4I1浓度下降(P=0.0302);与生理盐水组相比,毛柳苷组脑缺血再灌注后7 d和28 d血清中IL4I1浓度增加(P=0.0229,P=0.0076)。毛柳苷组脑缺血再灌注后7 d脑梗死体积较生理盐水组降低(P=0.0389)。与生理盐水组相比,毛柳苷组脑缺血再灌注后7 d缺血区周围小胶质细胞突起长度、突起数量、突起的分叉点及终末端点数量均增加(P=0.0040,P<0.001,P<0.001,P<0.001),皮层与纹状体区域M1型小胶质细胞数量减少(P=0.0407,P=0.0032),皮层与纹状体区域M2型小胶质细胞数量增多(P=0.0206,P=0.0075)。体外细胞实验BV2小胶质细胞不同表型中,M1型与M2型较M0型IL4I1表达下降(P=0.0008,P=0.0155),与M2型相比,M1型IL4I1表达更低(P=0.0406)。结论毛柳苷可能通过增加脑缺血再灌注损伤后血清及缺血脑组织中IL4I1的表达,并使激活的小胶质细胞向M2抗炎表型转化,减少脑梗死体积,从而发挥神经保护作用。

五花血藤化学成分的研究

目的对五花血藤(Sargentodoxa cuneata)的藤茎部分进行化学成分研究。方法五花血藤藤茎的95%乙醇提取物加水溶解后,分别用石油醚,醋酸乙酯和正丁醇萃取。正丁醇萃取物应用多种色谱柱及仪器进行分离纯化,并运用理化性质,核磁数据和光谱学数据等方法鉴定化合物的结构。结果从五花血藤藤茎中分离鉴定了12个化合物,分别为:毛柳苷(1)、3,4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷(2)、N-(对羟基苯乙基)阿魏酸酰胺(3)、eugenylβ-rutinoside(4)、原绿酸(5)、齐墩果酸(6)、(-)-表儿茶素(7)、2-苯乙基-β-D-呋喃芹糖基-(1″-6′)-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、β-谷甾醇(9)、胡萝卜苷(10)、3,4-二羟基苯乙醇(11)、豆甾醇(12)。结论化合物5、6、11为首次从该植物中分离得到。

圆苞金足草化学成分研究

目的研究圆苞金足草Goldfussia pentstemonoides全草的化学成分。方法采用色谱技术进行分离纯化,根据波谱数据并参考文献鉴定化合物结构。结果从圆苞金足草95%乙醇提取物的正丁醇萃取部位分离得到10个芳香类化合物,分别鉴定为毛柳苷(1)、3,4,5-三甲氧基苯酚-1-O-6-L-鼠李糖基-(1→6)-O-β-D-葡萄糖苷(2)、异类叶升麻苷(3)、isonuomioside A(4)、苯甲醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、淫羊藿次苷F2(6)、(-)-lyoniresinol 3α-O-β-D-glucopyranoside(7)、(+)-异落叶松脂素-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、脱咖啡酰基毛蕊糖苷(9)、dehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside(10)。结论所有化合物为首次从圆苞金足草中分离得到。

UPLC同时测定秦皮配方颗粒中7种成分

目的:建立UPLC同时测定秦皮配方颗粒中7种成分(秦皮甲素、毛柳苷、秦皮乙素、丁香苷、秦皮苷、秦皮素和东莨菪内酯)的方法,比较不同厂家及批次秦皮配方颗粒中7种成分含量的差异,为秦皮配方颗粒的科学质量控制提供依据。方法:采用Waters超高效液相色谱仪,Waters ACQUITY UPLC BEH C_(18)色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm),以甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0~1 min,5%~10%A;1~10 min,10%~12%A),流速0.4 m L·min^(-1),进样量2μL,柱温38℃,检测波长220 nm。结果:色谱峰纯度结果表明方法专属性良好。秦皮甲素、毛柳苷、秦皮乙素、丁香苷、秦皮苷、秦皮素和东莨菪内酯分别在各自范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系;平均回收率分别为100.0%(RSD 2.0%),99.5%(RSD2.1%),99.9%(RSD 1.5%),99.7%(RSD 2.2%),99.4%(RSD 1.4%),100.8%(RSD 1.8%),99.4%(RSD 2.6%)。结论:该方法简便、准确,适用于秦皮配方颗粒中7种成分的同时定量测定,分析时间明显缩短,并对秦皮配方颗粒中除秦皮甲素和秦皮乙素之外的多种成分首次进行了定量测定,不同厂家及批次的秦皮配方颗粒主要成分含量存在一定的差异。