紫花苜蓿毛状根转化体系的建立及应用

以紫花苜蓿品种WL-525HQ为材料,用发根农杆菌介导毛状根转化,分析毛状根分化率及转化率,筛选最优的转化方案,以快速获得紫花苜蓿转基因材料。结果表明:当发根农杆菌侵染苜蓿叶片的菌液浓度OD_(600)达0.5时,毛状根分化率可达72%;筛选培养基中添加5~8mg/L潮霉素时,毛状根的分化率及转化率都相对较高,分别为30.7%~33.2%和59.7%~67.9%,转化方案可靠;在以毛状根为外植体诱导全株时,采用羧苄青霉素能够有效抑制细菌,5mg/L潮霉素对愈伤组织的分化效果最好。优化了以毛状根为外植体探究紫花苜蓿全株的转化方案,并应用于耐铝基因MsLEA2研究,为紫花苜蓿功能基因研究提供了一种快速有效的手段。

发根农杆菌介导的白花草木樨毛状根转化体系的建立

白花草木樨(Melilotus albus Medic.ex Desr.)是草木樨最常见的栽培用种之一,具有较强的抗逆性和固氮能力。为了开发一套高效的草木樨转化体系,本研究以白花草木樨为材料,以结瘤基因MaROP6为目的基因,建立了发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的高效白花草木樨毛状根转化体系。结果表明:利用该方法可以在两周左右获得毛状根,其发生率可达78%,MaROP6基因的毛状根转化率可达70.8%。qRT-PCR鉴定结果表明,MaROP6转基因毛状根的平均相对表达量为对照的36.87倍。毛状根转化体系的建立为白花草木樨基因功能的验证奠定了基础。

发根农杆菌介导的柑橘黄龙病抗性快速评价体系优化及应用

【目的】黄龙病(Huanglongbing,HLB)是一种毁灭性柑橘病害,主要由韧皮部杆菌属亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)侵染引起。本研究旨在探究侵染初期CLas在柑橘毛状根中的增长规律,优化发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的黄龙病抗性快速评价体系并应用于抗菌肽的抗性评价。【方法】基于植物表达载体pGNGM1300,通过发根农杆菌K599介导的毛状根转化体系转化不同柑橘品种,筛选毛状根诱导快、转化率高的品种;接种CLas后,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)对毛状根中的CLas进行定期检测,揭示其增长规律;在优化黄龙病抗性评价体系的基础上,通过CLas和相关基因的(RT-)qPCR、胼胝质含量检测、显微结构观察和症状观察等开展抗菌肽的黄龙病抗性评价。【结果】供试的11个柑橘品种中,香橼(Citrus medica)的毛状根诱导最快(15 d)、诱导率最高(73.75%),并且毛状根中转基因阳性率高(53.54%)。qPCR定期监测结果显示,在接种后第20—30天(days post inoculation,dpi),CLas开始在根中定殖;在30—50 dpi,CLas含量呈显著上升的趋势;CLas含量在60—120 dpi时略有波动,但与50 dpi时差异不显著。抗菌肽MaSAMP(stable antimicrobial peptide)、HBD-4(homo sapiens defensin beta 4)和CB(cecropin B)的抗性评价结果分析显示,在50—120 dpi,MaSAMP和CB表达植株中CLas含量均低于对照,且差异显著,除90 dpi外HBD-4表达植株中CLas含量也显著低于对照。3种抗菌肽表达植株中的胼胝质含量均显著低于对照(60 dpi),韧皮部细胞壁增厚不明显,未出现明显的淀粉粒和胼胝体沉积,并且均未发现根部死亡等现象(90 dpi)。【结论】揭示了侵染早期CLas在柑橘毛状根中的增长规律;优化了发根农杆菌介导的黄龙病抗性快速评价体系;明确转基因过表达抗菌肽MaSAMP、HBD-4和CB可显著抑制CLas的增殖,减少胼胝质沉积,减轻黄龙病症状,具有用于黄龙病防控实践的潜力。

发根农杆菌介导的茶树遗传转化

发根农杆菌介导的茶树遗传转化奚彪１刘祖生１梁月荣１杨秀芳１黄卫红１须健２何玉科２白永延２（１浙江农业大学，杭州３１００２９；２中科院上海植生所，上海２０００３２关键词：发根农杆菌次生代谢多酚遗传转化毛状根Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒ...

绿豆GR基因生物信息学分析及其CRISPR/Cas9重组载体的构建与转化

绿豆(Vigna radiata L.)是一种严格闭花授粉作物,其人工授粉效率低、成本高,通过杂交获取新品种较为困难。目前,国内外绿豆遗传转化体系鲜见报道,这极大地限制了绿豆基因功能的研究和新品种的开发,因此尝试建立绿豆遗传转化途径具有重要意义。首先对绿豆谷胱甘肽还原酶基因(GR)进行生物信息学分析,并以此为基础,构建基因编辑重组体,同时进行发根农杆菌的遗传转化。结果表明,GR蛋白相对分子质量为58.38 kDa,稳定性较好,为亲水蛋白,有多个磷酸化位点,不含跨膜结构,定位于细胞质中,二级结构主要包括ɑ-螺旋和延伸链,且含有Pyr_redox_2和Pyr_redox_dim两个结构域;系统进化分析发现该蛋白与赤豆(Vigna angularis)亲缘关系最近。在此基础上构建四靶点CRISPR/Cas9-GR-gRNA基因编辑载体,通过发根农杆菌遗传转化绿豆子叶节获取毛状根20株,后经PCR检测获取阳性克隆毛状根12株,其毛状根转化率约为60%,其研究结果可为绿豆后续基因编辑研究奠定重要基础。

Ri质粒人参转化系统的建立及鉴定

目的 :建立人参毛状根转化体系。方法 :利用含有Ri质粒的发根农杆菌Agrobacteriumrhizogenes感染人参Panaxginseng进行毛状根诱导 ,利用PCR技术及TLC分析方法对毛状根进行鉴定。 结果 :首次从人参带叶幼茎处诱导出毛状根 ,用激素和AS(乙酰丁香酮 )处理可提高转化率并缩短转化时间。毛状根在无激素B5培养基上生长并失去向地性 ,月增长倍数可达 5 0倍 (鲜重 )。PCR分析证实农杆菌Ri质粒含有rolC序列 (5 6 4bp)的T DNA已整合到人参转化株的染色体组中 ,TLC分析证明T DNA特异的表达产物冠瘿碱在转化细胞中合成。人参毛状根中人参总皂苷含量为 2 .486 % (干重 ) ,而人参原药材总皂苷含量为 1.40 3% (干重 )。结论 :人参毛状根生长迅速 ,皂苷含量高于原药材 ,该体系的建立为利用生物技术工业化生产人参活性成分奠定了基础。

Ti和Ri质粒对栝楼双转化的研究

目的 :建立栝楼双转化毛状根培养系统。方法 :①利用根癌农杆菌Agrobacteriumtumefaciens菌株C5 8感染栝楼Trichosantheskirilowii.无菌苗诱导冠瘿瘤 ,然后用发根农杆菌Agrobacteriumrhizogenes菌株 15 834感染其再生植株 ,诱导出毛状根 ;②用纸电泳检测Ti和Ri质粒是否转化成功 ;③运用分光光度计和SDS PAGE检测栝楼组织中所含蛋白。结果 :Ti和Ri质粒转化成功并建立了栝楼双转化毛状根培养系统。结论 :双转化毛状根与一般毛状根相比 ,具有生长更迅速等特点而蛋白含量基本一样 ;因此 。

Biotransformation of Artemisinin by Hairy Root Cultures of Rheum palmatum L.

The biotransformation of artemisinin by hairy root cultures ofRheum palmatum L. was investigated for the first time. The main product, deoxyartemisinin, was isolated and characterized on the basis of its spectral data.