毛细管等电聚焦/毛细管无胶筛分电泳二维蛋白质分离平台的构建

设计并制作了一种新型的中空纤维接口 ,以此为核心构建了毛细管等电聚焦 (CIEF) /毛细管无胶筛分 (CNGE)电泳二维蛋白质分离技术平台 ,实现了将二维凝胶电泳从平板转移到毛细管中。利用该二维分离平台 ,对血红蛋白样品进行了高效、快速分离分析 ,验证了该二维分离平台的可行性及分离效能。实验结果表明 :二维分离系统总的峰个数和分离效能都比各自一维分离系统有较大提高。

基于温敏性N,N-二甲基丙烯酰胺/N-异丙基丙烯酰胺无规共聚物的毛细管无胶电泳筛分介质

本文合成了N,N-二甲基丙烯酰胺/N-异丙基丙烯酰胺无规共聚物(P(DMA-co-NIPAM))和聚N,N-二甲基丙烯酰胺(PDMA),并将二者共混制备毛细管无胶电泳筛分介质,旨在降低筛分介质粘度的同时增强其对DNA的分离性能。核磁共振氢谱(1H NMR)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)证明了2种聚合物的成功合成。表征了P(DMA-co-NIPAM)/PDMA共混物溶液的流体力学直径(Dh)、低剪切粘度和吸光度,结果表明,P(DMAco-NIPAM)聚合物具有温敏性,低临界溶解温度(LCST)为60~80℃。DNA筛分结果显示,PDMA中添加了10%P(DMA-co-NIPAM)的复合筛分介质性能最好,相比PDMA粘度降低19%以上,对大DNA片段的分辨率和理论塔板数均明显提高,分离时间缩短4%,显示了优良的分离性能。

毛细管SDS无胶筛分电泳测定小分子多肽相对分子质量

目的建立快速毛细管SDS无胶筛分电泳法（SDS—NGS），测定小分子多肽相对分子质量。方法涂层毛细管（管长30cm，内径100μm）；分离电压为9kV（300V／cm），分离温度为20℃；检测波长为214nm，检测时间为18min；所用SDS-多肽相对分子质量标准范围为2512—16949；以橙G（06）为内标参照物。结果在相对分子质量2512—16949范围内，多肽相对分子质量的对数与其相对迁移率具有良好的线性关系（r=0．996）；应用该方法测定了重组人奈西立肽、重组人表皮生长因子、虎纹镇痛肽、重组人心钠肽4种重组小分子多肽的相对分子质量，所测结果变异系数CV均小于3％。结论毛细管SDS无胶筛分电泳方便快速，灵敏度高，重现性好，结果准确，可作为小分子多肽相对分子质量的检测方法。

无胶筛分毛细管电泳法测定猕猴血浆中的反义寡核苷酸药物癌泰得

采用两步固相萃取(SPE)法结合无胶筛分毛细管电泳(NGCE)技术建立了猕猴血浆中的反义寡核苷酸药物癌泰得的定量分析方法。优化并确定了SPE的相关条件(阴离子交换柱,上样缓冲液pH值为9.0,上样体积及洗脱体积分别为5mL和3mL)和NGCE的分析条件(灌胶时间为30min,分离电压为24kV)。在优化的条件下,猕猴血浆中癌泰得在1.95～250mg/L范围内呈良好的线性关系,定量限(LOQ)为1.95mg/L。批内准确度为93.38%～100.71%,批内相对标准偏差<11%;批间准确度为89.46%～103.46%,批间相对标准偏差<9%。在不同条件(室温下存放4h;4℃下存放24h;反复冻融(-80℃至室温)2次;-80℃下保存1个月)下癌泰得在猕猴血浆中的稳定性良好。已将该方法成功地应用于癌泰得的猕猴药代动力学研究。

无胶筛分毛细管电泳法检测DNA的条件优化

毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE），又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是20世纪80年代问世的一种高效液相分离法。CE作为一种高效、微量、高灵敏度及自动化的分离分析方法，已在医学、生物学、生命科学等领域引起广泛关注。

无胶筛分毛细管电泳在分析苹果发育时期转变蛋白质变化规律中的应用

对无胶筛分毛细管电泳体系的筛分介质浓度、缓冲体系的离子强度、分离电压、进样量及温度等条件进行了优化,最终确定最佳分离条件为7.5% Dextran,7.5%丙三醇,0.15mol.L-1TB,0.1%SDS,分离电压23.5kV,进样量1.5psi×90秒,温度25°C。应用此方法对金冠×红玉苹果杂种后代韧皮部蛋白质进行测定,得到了多个与阶段转变相关的蛋白质,在韧皮部50节上,有分子量为5.0kDa的特异蛋白质出现,分子量为24.5kDa的蛋白质含量在阶段转变过程中明显升高。

聚环氧乙烷无胶筛分毛细管电泳分离宽分子量范围DNA片段

在无胶筛分毛细管电泳中,以聚环氧乙烷为筛分介质,用硅烷化处理的毛细管柱(31.2 cm×75μmi.d.,有效长度21.0 cm)分离DL5000 DNA Marker(DNA长度为100～5000 bp),考察了筛分介质浓度、缓冲液pH值、分离电压和溴化乙锭浓度对分离双链DNA片段的影响,优化得到分离100～5000 bp DNA片段的最佳条件.毛细管电泳的最佳条件为PEO浓度5 mg/mL,缓冲液pH值8.0,电压-12.0 kV及溴化乙锭浓度3.0μg/mL.在此条件下,可对山梨醇脱氢酶基因(SDH)和乙烯受体基因(ETR1)的聚合酶链式反应(PCR)扩增产物同时进行检测,分离和鉴定效果良好.

葡聚糖为筛分介质的无胶筛分毛细管电泳相互作用分析

本文利用线性高分子聚合物葡聚糖对大分子物质的筛分作用,通过改变大分子蛋白的电泳淌度,扩大迁移时间窗口,将无胶筛分毛细管电泳成功地运用于相互作用分析中,测定了伊贝沙坦与牛血清白蛋白之间的结合常数,建立了测定具有相似淌度的药物与蛋白之间结合常数的模型,进一步发展了毛细管电泳相互作用分析方法.

转基因玉米的多重PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光检测方法研究

采用三重PCR反应,同时扩增CaMV 35S启动子、hsp70 intron1和CryIA(b)基因之间序列以及Invertase基因,扩增产物用无胶筛分毛细管电泳-激光诱导荧光检测,从而建立了多重PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光快速检测转基因玉米的新方法.对影响多重PCR扩增和毛细管电泳的因素进行了优化.在优化的条件下,本方法可以同时检测转基因玉米样品中3种外源基因.经序列测试证实,三重PCR扩增产物的序列与原基因完全一致,表明扩增结果可靠.该方法能检出0.05%MON810转基因玉米成分,远低于欧盟对转基因食品规定标识的质量分数阈值(1%).该方法对玉米及其制品的检测结果与实时荧光PCR方法的检测结果一致,与传统的琼脂糖凝胶电泳法相比,具有特异性高、快速及灵敏等优点,适用于玉米中转基因成分以及转基因玉米MON810品系的快速筛选、鉴定和检测,能满足我国实施转基因食品标签法规的要求.

肺癌组织蛋白质混合物检测方法学研究

采用无胶筛分毛细管电泳-激光诱导荧光法(NGS-CE-LIF)检测蛋白质,考察了分离条件对分离的影响,并对提取的肺癌组织蛋白质混合物进行分析,与毛细管电泳紫外检测(CE-UV)及常规蛋白质检测手段聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行比较。异硫氰酸酯(FITC)衍生蛋白质,筛分介质为0.05%(w/V)聚环氧乙烷(PEO,Mr=300000),以TBE缓冲液(pH10.0)为电极缓冲液,分离电压为15kV,柱温15℃,氩离子激光器(λex=488nm,λem=520nm)检测。在此条件下可对6.5～200kDa范围的蛋白质进行分离,分离效果较好,15min内完成分离,理论塔板数(N)均值为9.12×104/m,检出限为0.28mg/L。结果表明,本方法具有筛分介质浓度调节简便,分离效果好,时间短等优点,具有一定的实际应用价值;对提取肺癌组织蛋白质混合物进行检测,检测效率和效果优于CE-UV及PAGE。

脱氧核糖核酸-蛋白质相互作用产物的检测及其在胃癌组织中的应用

建立了无胶筛分毛细管电泳-激光诱导荧光(Non-gel sieving capillary electrophoresis with laser inducedfluorescence,NGS-CE-LIF)检测脱氧核糖核酸(DNA)-蛋白质相互作用产物的方法。考察了筛分介质聚环氧乙烷(Poly(ethylene oxide),PEO)浓度、分离温度、分离电压及缓冲液三羟甲基氨基甲烷硼酸(Tris-Borate-ED-TA,TBE)pH值等条件对pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker和Protein Molecular Weight Marker(Broad)D532S相互作用产物的影响。结果表明,当PEO浓度为0.1%,TBE的pH为9.0,分离电压为15 kV,分离柱温15℃时,DNA-蛋白质相互作用产物得到有效分离。本方法应用于人胃癌组织p53基因扩增后的PCR产物和从相应组织中提取的蛋白质二者相互作用产物时,检测效率高,分离效果好。

鹿茸毛细管电泳DNA指纹图谱研究

目的采用随机扩增DNA多态性(RAPD)技术扩增鹿茸的线粒体DNA,扩增产物用无胶筛分毛细管电泳紫外检测,从而建立鹿茸的高效毛细管电泳-随机扩增DNA多态性(HPCE-RAPD)指纹图谱。方法对影响聚合酶链式反应(PCR)扩增和毛细管电泳的因素进行优化,在20 mmol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4-2 mmol·L-1EDTA缓冲溶液[0.8%(W/V)HPMC,15 mmol·L-1TBAP,pH 7.3]、进样电压-10 kV、分离电压-8 kV的优化条件下,对梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸以及人工伪鹿茸进行分析。结果将获得的指纹图谱进行相似度分析,发现不同鹿茸样品的指纹图谱相似度有明显区别,可用于鹿茸样品的快速真伪鉴别。结论 HPCE-RAPD指纹图谱结合了RAPD技术多态性丰富、检出率高、技术简便和毛细管电泳高效、快速、灵敏等优点,适用于鹿茸及其伪品的快速鉴别,通过进一步研究,本方法还可广泛应用于其他易混中药材的快速鉴别。

国产遗传分析仪测序模块优化设计研究

本文使用国产24道遗传分析仪搭配国产36 cm毛细管阵列,解决无胶筛分毛细管电泳技术为基础的遗传分析仪在测序中荧光信号校正、运行电压、迁移校正问题。以24道遗传分析仪原始光谱荧光信号为基础,建立光谱校正模型,获得基线噪声阈值。通过运行电压与峰间距值绘制标准曲线,利用测序分析软件计算清晰片段长度,确定最佳运行电压和峰间距,进而计算迁移偏移值,建立碱基大小与迁移时间的线性模型,实现碱基的准确识别。研究表明,在合适的光谱校正和基线噪声阈值限制下,当运行电压设置为10 kV,峰间距为13.05帧时,分析仪的最长清晰片段检验能力最强,为561 bp。通过迁移修正值的补偿,建立碱基大小与迁移时间的线性模型,碱基G、A、T、C的R2(标准曲线)值分别从0.9927、0.9927、0.9945、0.9879提高到0.9996、0.9998、0.9996、0.9997,且修正后,各个荧光标记的碱基均能得到正确标记,无漏标和错标,清晰片段长度延长到621 bp。本研究可以指导国产遗传分析仪测序模块的优化和设计,使分析仪的DNA碱基识别功能更高效和准确。