全柱成像等电聚焦毛细管电泳法对双特异性Fc融合蛋白的电荷异质性分析

建立全柱成像等电聚焦毛细管电泳(WCID-CIEF)分析双特异性Fc融合蛋白电荷异质性方法。方法 通过非还原毛细管电泳法观察酶处理前后峰型的变化,初步确认了该Fc融合蛋白电荷异质性唾液酸相关;结合唾液酸酶酶切和方法优化手段,建立了此融合蛋白的WCID-CIEF分析平台;通过液相质谱法(LC-MS)鉴定了唾液酸相关N-糖构型;通过液相荧光法(LC-FLR)测定了唾液酸的含量。结果 经唾液酸酶酶切和方法优化后,此方法在2.5~7.5 mgmL-1浓度范围内线性良好,R2=0.998,回收率在96.3%~104.6%之间,准确性、专属性和耐用性均满足要求。结论 结合酶处理和方法优化手段,WCID-CIEF可较好地分析融合蛋白的电荷异质性,提供了一种简单、有效的融合蛋白质控手段,并可应用于产品放行及稳定性监测。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术在重组蛋白疫苗电荷异质性分析中的应用

重组蛋白分子表征的稳定性是保证疫苗发挥免疫原性及抗原性的关键。重组蛋白疫苗与治疗性蛋白制品一样,因体外合成和纯化过程的复杂性而表现出异质性。其中,电荷异质性是重组蛋白质的关键质量属性之一。电荷异质性监测有助于推动生产工艺的优化,反映产品生产的一致性和稳定性等,对保证重组蛋白产品的安全和质量至关重要。开发可靠快速、灵敏稳健的电荷异质性分析方法一直是生物制药行业所追求的目标。经典的电荷异质性分析方法主要有离子交换色谱(IEC)、毛细管区带电泳(CZE)以及全柱成像毛细管等电聚焦电泳(WCID-CIEF)等,其中WCID-CIEF提供的等电点(pI)和峰形的生化指纹有助于对疫苗多蛋白成分的分析。基于以上该文将对WCID-CIEF的原理和特点及其在重组蛋白疫苗质量控制中的应用进行概述。

毛细管等电聚焦/毛细管无胶筛分电泳二维蛋白质分离平台的构建

设计并制作了一种新型的中空纤维接口 ,以此为核心构建了毛细管等电聚焦 (CIEF) /毛细管无胶筛分 (CNGE)电泳二维蛋白质分离技术平台 ,实现了将二维凝胶电泳从平板转移到毛细管中。利用该二维分离平台 ,对血红蛋白样品进行了高效、快速分离分析 ,验证了该二维分离平台的可行性及分离效能。实验结果表明 :二维分离系统总的峰个数和分离效能都比各自一维分离系统有较大提高。

毛细管等电聚焦分离蛋白质

采用均匀设计法进行未涂壁石英毛细管等电聚焦研究，考察两性电解质、甲基纤维素、四甲基乙二胺和牛磺酸几种组分对等电聚焦的影响，确定出了比较合适的浓度范围。当中性蛋白质迁移通过检测窗后，在进样端施加一低气压，从而使酸性蛋白质得到很好的分离，适用于较宽的ｐＩ范围。方法的重复性好，为蛋白质分离鉴定提供一种有力的工具。

新型固定化pH梯度毛细管等电聚焦方法用于蛋白分离

通过化学键合建立一种固定化pH梯度的方法,用于毛细管等电聚焦分离蛋白质。采用微流控泵驱动毛细管内的聚焦区带,通过调节泵的流量,从而调节聚焦区带的迁移速度。该方法避免了自由溶液聚焦时两性电解质所带来的影响,实现了高灵敏度及检测波长自由选择等优点,适用于两步法毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质等两性电解质。本文考察了对牛血清白蛋白和血红蛋白两种蛋白质混合物的分离,证明了该方法可行。

毛细管等电聚焦和电渗泵驱动聚焦区带分离蛋白质

建立了一种利用电渗泵驱动毛细管内的聚焦区带,实现毛细管电泳等电聚焦分离蛋白质的方法。通过控制电压来调节泵的输出流量,从而调节聚焦区带的迁移速度。适用于毛细管电泳等电聚焦两步法分离蛋白质等两性物质。考察了对牛血清白蛋白和溶菌酶两种粗提蛋白质混合物的分离,迁移时间的RSD分别为1.6%和1.3%,峰面积的RSD均为1.6%,证明方法可行。

毛细管柱表面鸡卵清蛋白快速改性并用于等电聚焦电泳分离蛋白质

开发了一种利用鸡卵清蛋白改性毛细管柱内表面的快速方法。改性后的毛细管柱可避免蛋白质样品的吸附作用 ,在较温和的条件下 ,柱性能有很好的稳定性 。

毛细管等电聚焦-毛细管区带电泳二维蛋白质分离平台的构建及其性能

A two-dimensional separation platform of capillary isoelectric focusing(CIEF)-capillary zone electrophoresis(CZE) for proteins was constructed by a microdialysis hollow fiber interface. The interface provided ease of fabrication,speed of mass delivering and convenience of column switching. Chrome c was selected to demonstrate the 2D separation systems feasibility and resolving performance. The 2D separation system was found to greatly increase the resolving power and overall peak capacity over those obtained for either dimension alone.

毛细管等电聚焦分离蛋白质

毛细管等电聚焦（CIEF）可分离等电点（pI）相差0．02pH单位的蛋白质。本文介绍了CIEF分离蛋白质的基本原理、方法和特点；阐述了CIEF分离蛋白质应解决的基本问题，包括消除或减小电渗的涂层方法。检测方法和条件。蛋白质区带的迁移及pI测定方法。讨论了影响CIEF分离效能的因素，如两性电解质的组成和浓度、毛细管长度、聚焦电压等。列举了应用CIEF分离具有不同pI蛋白质混合物的实例，对CIEF的应用前景进行了展望。

压力驱动的毛细管等电聚焦分离牛血清白蛋白和血红蛋白

蛋白质的聚焦过程完成后,实现了压力驱动毛细管内完成聚焦的聚焦区带迁移,进行聚焦区带的检测。实验证明,在较低流速下不会破环聚焦区带,得到了理想的分离结果,方法可行,且操作简单。

全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析蛋白质药物电荷异质性

评价了cIEF-WCID检测多肽与蛋白质药物等电点的应用效果。测定标准多肽的等电点,验证了cIEF-WCID具有高的准确度和良好的重复性(相对标准偏差<0.50%)。人血红蛋白的4种主要异构体实现了基线分离;甘赖胰岛素的重复测试均只检出单一特征峰(p I 5.95±0.01);比较重组人生长激素原液和成品,等电点特征峰比例差异明显,且成品有新特征峰出现;对比进口及国产贝伐单抗,发现厂家1、3与原研药基本一致,厂家1的主成分迁移规律与原研药高度一致,厂家2的重链C末端K缺失、N末端焦谷氨酸环化或脱酰胺修饰影响了电荷异质性;通过考察尿素浓度、电解质范围和聚焦时间,优化了检测重组人促卵泡素等电点条件:2 mol/L尿素,两性电解质pH 2.5~5.0与pH 3.0~10.0按1∶1混合,聚焦电压1 000 V(1 min)~1 800 V(4 min)~2 200 V(1 min)。cIEF-WCID可快速、准确测定具有电荷异质性的蛋白类药物等电点,分辨率和重复性好,尤其是可以跟踪聚焦过程中样本的迁移特征,特别适合蛋白类药物复杂电荷异质性的检测。

用于蛋白质分析的毛细管等电聚焦-电喷雾质谱接口的改进

An important interface modification for capillary isoelectric focusing mass spectrometry(CIEF MS) is reported. A capillary needle with a sheath flow tube pre mounted in one device serves as both the CIEF cathodic end and the ESI interface. The needle was inserted into the cathode reservoir at the focusing stage, and then removed to the front of sampler orifice of MS at the detection stage. Therefore, the shut off of the high voltage is not necessary and a better focusing protein zone is maintained during the ESI stage. The optimization of the experimental condition has been investigated and the two dimensional image of the E. coli proteins has been obtained, which is comparable with that from a 2D gel.

微等电聚焦分离等位基因表达蛋白的研究

借助于显微操作方法，用等电聚焦和改进的超敏感染色技术对西葫芦单个花粉粒中的可溶性蛋白进行了电泳分析，获得了清晰的电泳图谱。在靠近酸性端有两条相距极近而且分布比较特殊的蛋白带，在第 １ 种植株中，这两条带稍微靠近酸性端；在第 ２ 种植株中，它们稍微远离酸性端；在第 ３ 种植株中，它们相同于第 １ 种和第２ 种，而且在两种之间的分布比例为 １∶１。

蛋白质分离与制备的新方法——电泳及等电聚焦

本文介绍了近二十年来分离蛋白质的新方法及制备型设备的进展.共分三大类:即电泳、场流分级和等电聚焦。介绍了其中的技术关键,如建立pH梯度的方法、流动方向与电场垂直的新概念以及近10年来发展的多种类型的制备装置。其中一些较好的装置的处理能力已超过制备型的凝胶色谱和亲和色谱装置,达到了每天分离几克到几百克蛋白质的水平。

一步法和两步法毛细管等电聚焦测定蛋白质和多肽等电点的比较

利用一步法和两步法毛细管等电聚焦(cIEF)方法分离测定了蛋白质和多肽的等电点(pI)。讨论了两步法等电聚焦过程所需的溶液组成、样品进样体积、聚焦电压、聚焦时间和分离条件等因素对分离效果的影响。并对一步法和两步法进行了比较。对细胞色素C、血红蛋白、肌红蛋白、转铁蛋白和牛血清白蛋白以及6种多肽的分析结果表明:一步法步骤简单,分离速度快,可测定单一组分的pI,也能快速分离混合蛋白和多肽,但分离度较差,且不能同时准确测定各组分的pI;两步法步骤复杂,分析时间较长,但能够同时分离并准确测定混合样品中各组分的pI,所测的pI值与单一组分进行测定的结果基本一致。两种方法可相互结合、互为补充,可广泛应用于两性生物微粒等电点的快速和准确测定。

等电聚焦预分离用于肝癌细胞分泌蛋白质组的分级与鉴定

分泌蛋白质组(secretome)是指在特定的时空条件下,细胞、组织等分泌的全部蛋白质。分泌蛋白质组可能包含了大量的疾病诊断生物标志物,因此其相关研究越来越受到重视。分泌蛋白质组的组成高度复杂且浓度范围宽,这对分析方法提出了挑战。建立有效的蛋白质或肽段预分离策略,将有利于分泌蛋白质的高覆盖率鉴定。本研究以肝癌细胞系MHCC97L的无血清培养分泌蛋白质为研究对象,采用一种新型等电聚焦预分离(OFFGEL)系统,考察了肽段水平的分级对蛋白质鉴定结果的影响。结果表明,分离后各馏分中肽段的等电点分布与理论预测基本一致,每个馏分中单独鉴定的肽段比例接近80%,显示了该系统对肽段的高分辨分离能力。结合生物质谱技术,在肝癌细胞分泌系统中鉴定了2 995个蛋白质,显示了该系统在复杂体系蛋白质组研究中的应用潜力。

纳米壳聚糖修饰的开管毛细管电色谱柱的制备及对碱性蛋白质的分离

采用离子交联法制得纳米壳聚糖粒子溶液,通过静电吸附作用将其修饰于石英毛细管内表面形成涂层毛细管柱.通过场发射扫描电子显微镜观察到毛细管内壁有小丘状突起,表明纳米壳聚糖粒子已吸附于柱内层.检测了不同p H值下的电渗流变化趋势并与裸柱比较,结果显示修饰后的柱电渗流受到明显抑制,并在p H<4.7的环境中能产生反向电渗流,该柱在不同p H值下电渗流的相对标准偏差(RSD)<6%,日内、日间和柱间的RSD分别为1.46%,4.64%和14.43%,表明柱稳定性较好.通过分离3种中性物质甲苯、苯酚和硫脲考察了该柱的色谱行为,出峰顺序与其极性大小顺序一致,表明纳米涂层起到极性固定相的作用.用该柱成功分离了3种碱性蛋白质溶菌酶、细胞色素c和核糖核酸酶A,柱效分别为39481,42610和245373Plate/m,重现性良好,表明纳米涂层可有效抑制碱性蛋白质的吸附作用.

固化pH梯度毛细管等电聚焦整体柱的制备及在蛋白质等电点分析中的应用

通过聚合物原位聚合反应,制备了部分填充的毛细管整体柱。pH3~10的载体两性电解质被固化在该毛细管整体柱上。在引入八通进样阀、三通阀和四通连接单元的基础上,构建了适用于固化pH梯度毛细管等电聚焦整体柱(M-IPG)的平台。在蛋白质药物测定过程中,用M-IPG柱和羟丙基纤维素(HPC)涂层毛细管柱同时对曲托珠单抗和依那西谱的等电点进行了测定。结果表明,两种等电聚焦柱都能够同时分离混合蛋白质样品并测定蛋白质类药物中单抗和融合蛋白质的等电点(pI),M-IPG柱所测的pI值与HPC涂层毛细管柱测定的结果基本一致,表明了该柱在进一步构建多维分离平台进行蛋白质组学研究方面的潜力。

吸附蛋白质固定相电色谱手性分离的研究

将牛血清白蛋白 (BSA)吸附于强阴离子交换固定相 (SAX)上用于电色谱手性分离。当SAX吸附BSA后 ,电渗淌度仅仅下降 2 6 3% ,而电渗流的方向没有改变。在该系统中电渗流的方向和阴离子的电泳方向一致 ,因而克服了一般蛋白质固定相不能分离酸性对映体的缺点。 1种中性对映体安息香和 4种阴离子性对映体色氨酸、华法令、非诺洛芬、酮基布洛芬获得了成功分离。当流动相含体积分数为 7%的乙腈时 ,死时间和D 色氨酸、L 色氨酸的迁移时间的相对标准偏差分别为 0 90 % ,0 87%和 0 96 % (n =2 1) ,说明该体系有很好的重现性。为了缩短分析时间 ,将正己酸作为顶替试剂加入流动相中 ,结果发现对映体的保留下降很快而手性选择性减小缓慢。此外 ,还考察了乙腈的体积分数对分离的影响。