三氧化二砷通过毛细血管扩张性共济失调突变和RAD3相关激酶通路上调KG1a细胞UL16结合蛋白1的表达

目的观察三氧化二砷(ATO)对急性髓系白血病细胞KG1a细胞表面NKG2D配体UL16结合蛋白1(ULBP1)表达的影响,探讨其调节ULBP1表达的分子机制。方法常规体外培养KG1a细胞,采用细胞增殖/毒性检测试剂(CCK8)检测不同浓度ATO对KG1a细胞的增殖抑制率;应用实时荧光定量反转录(RT)-PCR方法检测KG1a细胞ULBP1 mRNA表达的影响;流式细胞术检测ATO对KG1a细胞表面ULBP1蛋白表达的影响。加入毛细血管扩张性共济失调突变和RAD3相关激酶(ATM/ATR)抑制剂咖啡因,观察其是否影响ATO对KG1a细胞ULBP1 mRNA及蛋白的表达。采用Western blot法观察ATO对KG1a细胞中CHK1、CHK2蛋白及其磷酸化表达的影响。结果不同浓度(1、2、3、4、5μmol/L)ATO均可抑制KG1a细胞的增殖,呈浓度依赖性,其对KG1a细胞的半数抑制浓度(IC50值)为2.7μmol/L。荧光定量RT-PCR法检测结果示ATO可使KG1a细胞ULBP1 mRNA的相对表达水平升高,ATO在浓度分别为1、2、3、4、5μmol/L时,与未加药组比较,ULBP1 mRNA相对表达水平分别升高至(1.86±0.30)倍、(3.02±0.71)倍、(3.16±0.75)倍、(4.80±0.70)倍、(3.70±0.89)倍,差异均有统计学意义(均P<0.05);与未加药组相比,当ATO浓度分别为1、2、3、4、5μmol/L时,ULBP1蛋白相对表达水平均显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。咖啡因预先处理KG1a细胞2 h再联合ATO共同孵育KG1a细胞24 h,ULBP1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低。在咖啡因浓度为8 mmol/L时,ULBP1 mRNA相对表达水平由不用咖啡因处理组的(9.55±0.38)倍降为(6.36±0.93)倍,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测结果发现,当咖啡因浓度分别为2、4、8 mmol/L时,ULBP1蛋白相对表达水平由不用咖啡因处理组的(3.50±0.08)倍分别降为(2.17±0.07)倍、(2.02±0.06)倍、(1.75±0.06)倍,差异均有统计学意义(均P<0.05)。CHK1和CHK2蛋白相对表达水平均随ATO浓度的升高而降低,而CHK1和CHK2磷酸化蛋白的相对表达水平均随ATO浓度的升高而升高。结论ATO诱导上调KG1a细胞ULBP1 mRNA及蛋白的表达,ATM/ATR-CHK1/CHK2通路可能参与这一过程。

对映-贝壳杉烯型二萜类化合物J32对胰腺癌细胞的作用及机制

目的探讨对映-贝壳杉烯型二萜类化合物J32对胰腺癌细胞SW1990的作用及机制。方法将SW1990细胞随机分为对照组、0.5μmol·L^(-1) J32组、1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组,分别用含终浓度0.0、0.5、1.0、2.0、4.0μmol·L^(-1) J32的培养基培养。采用细胞划痕试验检测细胞迁移能力,单克隆形成试验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况、细胞中活性氧水平及细胞周期,磷酸化H2组蛋白家族成员X(γ-H2AX)免疫荧光法检测细胞DNA损伤程度,Western blot法检测共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)-细胞周期检查点激酶1(Chk1)-p53-细胞周期素D1(Cyclin D1)通路相关蛋白以及凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、caspase-3、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)表达。结果培养24、48 h时,1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的迁移能力显著低于对照组(P<0.05),2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的迁移能力均显著低于1.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05),4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的迁移能力显著低于2.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。0.5μmol·L^(-1) J32组、1.0μmol·L^(-1) J32组细胞的增殖能力显著低于对照组(P<0.05),1.0μmol·L^(-1) J32组细胞的增殖能力显著低于0.5μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的凋亡率显著高于对照组(P<0.05),2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的凋亡率显著高于1.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05),4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的凋亡率显著高于2.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的活性氧水平显著高于对照组(P<0.05),2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的活性氧水平显著高于1.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05),4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的活性氧水平显著高于2.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组细胞的DNA损伤程度显著高于对照组(P<0.05),2.0μmol·L^(-1) J32组细胞的DNA损伤程度显著高于1.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组细胞中G 1/S期细胞占比显著高于对照组(P<0.05),2.0μmol·L^(-1) J32组细胞中G 1/S期细胞占比显著高于1.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。对照组、1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞中,随着J32浓度的增加,磷酸化ATR/ATR值及磷酸化p53蛋白表达呈升高趋势(F=25.534、3.970,P<0.05),Chk1、CyclinD1蛋白表达呈降低趋势(F=19.532、0.485,P<0.05);促凋亡蛋白caspase-3、Bax的表达呈升高趋势(F=0.219、4.314,P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达呈下降趋势(F=0.324,P<0.05)。结论对映-贝壳杉烯型二萜类化合物J32可呈浓度依赖性地抑制胰腺癌SW1990细胞的迁移和增殖、促进细胞凋亡及提高细胞内活性氧水平,此外,J32可促进细胞发生DNA损伤及细胞周期阻滞,其作用机制可能与ATR-Chk1-p53-Cyclin D1通路相关。

ATR分子通路及其抑制剂抗肿瘤研究进展

共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶(ATR)是一种DNA损伤修复应答(DDR)机制的重要调节因子。研究发现,ATR分子通路通过多种细胞因子调控细胞DNA损伤修复,进而致使正常细胞发展为肿瘤细胞。ATR激酶也是一种能够抗肿瘤且不影响正常细胞的理想靶标,其抑制剂的开发引起广泛关注。目前,已经有相当多的ATR激酶抑制剂被开发出来,其中部分抑制剂展现出了显著的抑瘤效果,且已进入临床试验阶段,其单用或与其他药物联用的疗效和安全性有待进一步临床验证。

黄精对衰老大鼠内皮祖细胞DNA损伤检测点ATM/ATR通路的影响

目的观察黄精对衰老大鼠内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)体外传代培养过程中细胞周期及DNA损伤检测点毛细血管共济失调突变基因(Ataxia-telangiectasia mutated gene,ATM)/ATM与Rad3相关蛋白激酶(ATM and Rad3-related kinase,ATR)通路的影响。方法分离培养衰老大鼠骨髓EPCs并鉴定,将培养至第2代的EPCs分为4组,分别用黄精含药血清和空白对照血清继续培养至第4、6、8代,流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR和Western-Blot法检测细胞ATM、ATR、检测点激酶1(check point 1,Chk1)、检测点激酶2(check point 2,Chk2)mRNA及其蛋白的表达。结果 EPCs在体外传代培养过程中其细胞周期在G1期增多,在S期减少,细胞表达ATM、ATR、Chk1、Chk2 mRNA及蛋白水平显著升高(P <0.05),经黄精干预后,EPCs在传代培养中其细胞周期在G1期减少,在S期增多,细胞表达ATM、ATR、Chk1、Chk2 mRNA及蛋白显著降低(P <0.05)。结论黄精可通过抑制DNA损伤检测点ATM/ATR通路的活化来调节EPCs的细胞周期,干预EPCs的老化进程。

拓扑异构酶抑制剂通过ATM/ATR和NF-κB途径上调乳腺癌细胞MICA/B的表达

目的:分析常用化疗药物对免疫识别乳腺癌细胞重要的靶标主要组织相容性复合体Ⅰ类相关分子A和B(major histocompatibility complex classⅠ-related chain A and B,MICA/B)的影响,探讨其调节MICA/B表达的分子机制。方法:用荧光定量RT-PCR法检测化疗药物对乳腺癌细胞MICA和MICB mRNA表达的影响,流式细胞术检测化疗药物对MICA/B表面蛋白表达的作用。加入咖啡因抑制毛细血管扩张性共济失调突变和Rad3相关激酶(ataxia telangiectasia mutated and Rad3-related kinase,ATM/ATR),加入吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pynolidine dithiocarbamate,PDTC)抑制核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB),观察其是否能够抑制化疗药物中拓扑异构酶抑制剂对乳腺癌细胞MICA和MICB mRNA及蛋白的表达。凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测药物是否影响乳腺癌细胞NF-κB与MICA/B启动子区的结合。结果:三种拓扑异构酶抑制剂足叶乙甙、拓扑替康和阿霉素可使乳腺癌MCF-7细胞的MICA和MICB mRNA水平升高。足叶乙甙在浓度为5、20、100μmol/L时,与不加药处理组相比,MICA mRNA水平分别升高到(1.68±0.17)、(2.54±0.25)、(3.42±0.15)倍(P<0.05);MICB mRNA水平分别升高到(1.82±0.24)、(1.56±0.05)、(5.84±0.57)倍(P<0.05)。拓扑替康和阿霉素在特定浓度时也使MCF-7的MICA和MICB mRNA水平显著升高(P<0.05)。拓扑异构酶Ⅱ抑制剂足叶乙甙和拓扑替康处理另一乳腺癌细胞系SK-BR-3后,MICB mRNA的表达也轻度升高(P<0.05)。足叶乙甙和拓扑替康还增加MCF-7细胞表面MICA/B蛋白的表达(P<0.05),且存活和凋亡细胞MICA/B蛋白的表达均增高。用不同浓度的咖啡因处理足叶乙甙损伤的乳腺癌细胞,MICA/B mRNA和蛋白表达均显著降低,当咖啡因浓度为1、5、10 mmol/L时,MICA mRNA相对表达水平由不用咖啡因处理组的(3.75±0.25)倍分别降为(0.89±0.05)、(0.81±0.02)、(0.48±0.04)倍(P<0.001),MICB mRNA由(6.85±0.35)倍降为(1.36±0.13)、(0.76±0.06)、(0.56±0.03)倍(P<0.05),MICA/B蛋白表达由(3.42±0.05)倍降为(1.32±0.03)、(1.21±0.06)、(1.14±0.03)倍(P<0.001),表明足叶乙甙对MICA/B的上调作用能够被ATM/ATR抑制剂所抑制。同样,加入不同浓度的NF-κB的强抑制剂PDTC(10、50、100μmol/L),MICA/B mRNA和蛋白的表达均明显受到抑制(P<0.05),提示NF-κB也参与这一过程。EMSA实验显示,MCF-7细胞用足叶乙甙处理后,NF-κB与MICA/B基因启动子区的结合活性增强。结论:拓扑异构酶抑制剂诱导并上调乳腺癌细胞MICA和MICB mRNA及表面蛋白的表达,表明化疗药物有可能增强免疫系统对乳腺癌的识别和杀伤,ATM/ATR和NF-κB途径参与了这一过程。

人参皂苷Rg1诱导白血病K562细胞老化的研究

目的目前人参皂苷Rg1主要集中于对实体瘤和急性白血病的研究,涉及慢性白血病的报道较少。文中旨在探讨共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关蛋白(ATR)-检查点激酶1(Chk1)通路在人参皂苷Rg1诱导白血病K562细胞老化中的作用。方法采用不同浓度的人参皂苷Rg1处理K562细胞,分为对照组(加入50μL PBS培养液)、5μmol/L人参皂苷组、10μmol/L人参皂苷组、20μmol/L人参皂苷组、40μmol/L人参皂苷组、80μmol/L人参皂苷组。运用CCK-8法、集落形成实验和流式细胞术检测细胞周期确定人参皂苷Rg1对K562细胞老化的影响;SA-β-Gal染色法和Wright’s染色法观察K562细胞衰老形态学变化;实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞老化调控因子ATR和Chk1表达的改变。结果20μmol/L人参皂苷组K562细胞集落形成率较其他组明显降低(P<0.05)。CCK-8检测结果显示,人参皂苷Rg1各组分别诱导K562细胞24、48、72 h,K562细胞增殖能力较对照组升高(P<0.05);当20μmol/L人参皂苷组48 h时K562细胞增殖抑制率最高(P<0.05)。20μmol/L人参皂苷组作用48 h后,K562细胞SA-β-Gal染色阳性细胞率[(95.833±1.528)%]显著高于对照组[(3.083±0.764)%],阻滞在G0/G1期的细胞较对照组明显增高,进入S期和G2/M期的细胞较对照组明显减少(P<0.05);且ATR和Chk1 mRNA表达水平[(0.0117±0.0038)%、(0.0120±0.0021)%]较对照组[(0.0027±0.0006)%、(0.0058±0.0019)%]明显增高(P<0.05);ATR和Chk1蛋白相对表达水平[(19.370±0.994)%、(43.520±1.236)%]较对照组[(17.080±1.274)%、(39.100±0.969)%]明显上调(P<0.05)。结论人参皂苷Rg1可通过调控ATR-Chk1通路诱导K562细胞老化,可为临床白血病治疗提供新靶点。

ATR/CHK1通路在卵巢上皮癌发生发展中的作用机制研究

目的探讨共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶(ATR)/沉默细胞周期检测点激酶1(CHK1)信号通路在卵巢上皮癌发生、发展过程中的作用。方法体外培养人卵巢上皮癌细胞OVCAR3,分为空白对照组(NC组)、siRNAsc组(转染siRNAsc的OVCAR3细胞)、siRNAATR组(转染siRNAATR的OVCAR3细胞)、VE822组(加入1μmol/L的ATR抑制剂VE822)、和siRNAATR+VE822组。采用siRNA技术和VE822干扰OVCAR3细胞中的ATR,通过实时荧光定量PCR(qRTPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中ATR的表达确定干扰有效后,CCK8法检测各组细胞增殖抑制情况,流式细胞术(FCM)检测细胞周期和凋亡情况,qRTPCR检测卵巢上皮癌细胞中凋亡相关基因半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(Bax)mRNA的表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测ATR/CHK1通路相关蛋白的表达。结果siRNA-ATR转染和VE-822干预后,与NC组和siRNA-sc组相比,siRNA-ATR组、VE-822组、siRNA-ATR+VE-822组OVCAR3细胞中ATR的mRNA[(1.55±0.12)、(1.51±0.13)、(0.71±0.11)、(0.73±0.12)、(0.49±0.09)]表达水平显著降低(P<0.05),细胞增殖抑制率[(0.00±0.00)%、(0.00±0.00)%、(32.84±1.08)%、(30.75±1.44)%、(43.90±1.57)%]、细胞G0/G1期的比例[(40.08±2.57)、(36.35±3.44)、(53.28±4.34)、(56.37±5.03)、(70.63±3.81)]、细胞凋亡率[(4.28±0.67)%、(5.35±0.94)%、(23.63±1.13)%、(24.57±1.20)%、(35.86±1.09)%]、Caspase-3、Bax mRNA表达明显升高(P<0.05),S期[(32.93±3.02)、(35.35±2.82)、(25.79±3.61)、(23.74±3.54)、(18.04±2.37)]和G2/M期[(26.99±2.84)、(28.30±2.72)、(20.93±3.01)、(19.98±2.87)、(11.33±2.11)]的细胞比例、Bcl-2 mRNA、ATR、p-CHK1/CHK1、细胞分裂周期蛋白25C(CDC25C)、细胞周期蛋白B1(cyclin B1)蛋白表达显著降低(P<0.05);与siRNA-ATR组相比,siRNA-ATR+VE-822组细胞中ATR的mRNA表达水平进一步降低(P<0.05),细胞增殖抑制率、细胞凋亡、Caspase-3、Bax mRNA表达进一步增加(P<0.05),Bcl-2 mRNA、ATR、p-CHK1/CHK1、CDC25C、cyclin B1蛋白表达持续降低(P<0.05)。结论ATR/CHK1信号通路在卵巢上皮癌OVCAR3细胞增殖过程中被激活,抑制ATR/CHK1信号通路,可抑制卵巢上皮癌细胞增殖,诱导其G1/S细胞周期阻滞和细胞凋亡。