绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9基因的扩增及表达

本试验旨在构建绵羊毛角蛋白Ⅱ型中间丝9(keratin typeⅡintermediate filament 9,KIFⅡ-9)基因cDNA的毛囊特异性表达载体,转染辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达外源基因并可用于核移植的转基因细胞克隆。通过PCR扩增得到的KAP6-1基因启动子,然后与RT-PCR扩增得到的KIFⅡ-9 cDNA序列连接构成皮肤特异性表达载体pcDNA3.1-KK,将重组表达载体以脂质体介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得转基因细胞克隆,结果显示,外源KAP6-1启动子序列和KIFⅡ-9 cDNA整合到细胞基因组中,为下一步通过核移植方法获得转基因绒山羊提供了条件。

绵羊角蛋白中间丝I型基因多态性及其与羊毛性状的关系

采用PCR-RFLP分子标记技术,检测了湖羊、哈萨克羊及中国美利奴多胎羊、"A"型羊和细型、超细型羊5个群体,共314只个体,角蛋白中间丝I型基因第1外显子的遗传多态性,并进行与绵羊羊毛性状相关性分析。结果表明:480 bp PCR产物经M spⅠ消化分析后在5个绵羊群体中均有2个等位基因突变(M占0.910 8,N占0.089 2)和3种基因型(MM占0.839 2,MN占0.141 5,NN占0.019 3),优势等位基因M基因频率比欧洲绵羊和印度绵羊品种高。序列比对发现,第1个M spⅠ酶切位点发生1个碱基C→T突变(g.160 C>T)。中国美利奴羊在该位点处于Hardy-W e inberg不平衡状态(P<0.05),其中中国美利奴细型、超细型群体在该位点处于Hardy-W e inberg极不平衡状态(P<0.01)。该位点与羊毛纤维直径不相关。

寻常型鱼鳞病一家系Filaggrin基因突变分析

目的对寻常型鱼鳞病(ichthyosis vulgaris,IV)一家系中间丝聚合蛋白(Filaggrin,FLG)基因中可能出现的突变进行检测。方法提取IV家系成员和100份无亲缘关系正常人外周血基因组DNA,采用聚合酶链反应法(PCR)及直接测序法,对FLG基因已报道的13个突变位点(3321delA、1249insG、441delA、S3296X、E1795X、R501X、R2447X、2282del4、S2889X、3702delG、7945delA、R4307X、Q2417X)进行测序。结果 2代4位成员中2例IV患者同时检测到FLG(3321delA)基因突变。家系中正常人及无亲缘关系对照均未发现突变。结论家系中存在FLG(3321delA)基因突变,导致编码蛋白的结构和功能发生改变。

山区型和田羊毛囊KIF2.9基因的克隆与生物信息学分析

为了探究毛囊KIF2.9基因对半粗毛型地方品种绵羊羊毛品质和性状的影响,试验以山区型和田羊为试验动物,提取毛囊总RNA,反转录成cDNA,PCR扩增毛囊KIF2.9基因,并定向插入pMD18-T克隆载体中构建pMD18-T-KIF2.9克隆质粒,经双酶切、PCR鉴定及测序分析正确后,将山区型和田羊毛囊KIF2.9基因连接到原核表达载体pET-28a(+)中,构建毛囊KIF2.9基因的pET28a(+)-KIF2.9原核表达重组质粒,检测其正确性,并运用DNAMAN、ProtParam、ExPASy、MEGA 5.0等软件对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明:山区型和田羊毛囊KIF2.9基因编码序列大小为1527 bp,编码509个氨基酸。与GenBank中美利奴羊比较,毛囊KIF2.9碱基序列有20处碱基发生突变,但仅造成第292位丙氨酸→缬氨酸,第414位谷氨酰胺→谷氨酸,第466位色氨酸→苏氨酸这3处氨基酸的变异。与美利奴羊毛囊KIF2.9基因的序列比对,其碱基同源性为98.69%,但氨基酸序列同源性高达99.41%。与美利奴羊毛囊KIF2.9基因蛋白结构比对,蛋白质一级结构中原子总数、分子质量、脂肪酸系数略高于美利奴,氨基酸数目、等电点、平均疏水性等无明显差异;蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链所占比例没有明显差异;蛋白质三级结构中某些肽段结构发生了变化。KIF2.9基因分子系统进化树反映山区型和田羊与美利奴羊亲缘关系较近。说明山区型和田羊与美利奴羊的羊毛类型有差异,但毛囊KIF2.9基因在氨基酸水平上高度相似,亲缘关系较近。

转K2.9基因绒山羊体细胞核移植技术体系的优化研究

【目的】利用体细胞核移植技术制备转毛角蛋白Ⅱ型中间丝K2.9基因的高绒质绒山羊胚胎,为绒山羊优良品种的培育提供一种全新的技术材料。【方法】以含有Neor基因标记的K2.9毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得转K2.9基因细胞,将获得的转基因阳性细胞与体外成熟的绒山羊卵母细胞进行核移植,并对生产的重构胚进行了体外培养。本文分别进行了激活方法、供体细胞和卵母细胞来源的筛选,且对获得的囊胚进行了PCR鉴定。【结果】(1)Iono+6-D对成年羊卵母细胞的孤雌激活效果好于A23187+6-D,显著提高了胚胎的卵裂率。(2)羔羊孤雌胚的卵裂率显著低于成年羊,但囊胚率差异不显著。(3)来自2只绒山羊胎儿的转基因成纤维细胞对核移植胚的发育没有显著影响,但2号羊的转基因细胞显著提高了融合率。(4)以羔羊卵进行核移植,显著降低了核移植胚的发育率。(5)对获得的囊胚进行PCR鉴定,成功扩增到目的基因。【结论】将K2.9毛囊特异表达载体pcDNA3.1-K转染的绒山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞,核移植到成年羊卵母细胞中,以Iono+6-D进行激活,首次成功、高效地获得携带K2.9基因的绒山羊囊胚。

Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶Hepsin、抑癌基因Maspin在胃癌中的表达及其临床意义

本研究旨在探讨Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶Hepsin、抑癌基因Maspin在胃癌中的表达及意义,现报道如下.一、资料与方法：1.一般资料：收集东阳市人民医院病理科2008年1月至2013年12月归档的病例资料完整的200例胃癌标本,术前均未行放化疗或内分泌治疗.同时另取距离胃癌肿块边缘＞5 cm的癌旁胃黏膜组织石蜡标本为对照.其中男121例,女79例,年龄（42.0±6.5）岁.

CLDN1与TMPRSS4在肝癌中的表达及其临床意义

目的:探讨细胞紧密连接蛋白1(CLDN1)和Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)在肝癌中的表达及其临床意义。方法:选取手术前未行放化疗的临床肝癌组织标本89例,并选取55例非肝癌组织标本作为对照组,通过免疫组化染色法检测CLDN1与TMPRSS4的表达水平,并且分析CLDN1和TMPRSS4表达与患者临床病理特征和预后的关系。结果:CLDN1在肝癌组织中的表达阳性率为65.2%,而在非肝癌组织中的表达阳性率为25.5%,差异具有统计学意义(P<0.001);TMPRSS4在肝癌组织中的表达阳性率为73.0%,而在非肝癌组织中的表达阳性率为30.9%,差异具有统计学意义(P<0.001)。CLDN1和TMPRSS4的表达与患者肿瘤分化程度、TNM分期相关。Spearman相关性分析提示TMPRSS4与CLDN1表达水平呈正相关。CLDN1和TMPRSS4高表达组生存率均低于CLDN1和TMPRSS4低表达组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:CLDN1与TMPRSS4在肝癌的发生、发展过程中可能起着协同作用,联合检测CLDN1与TMPRSS4可能对判断肝癌的预后具有一定指导意义。