在铺有鼠尾胶原的TransWell培养板套皿气-液交界面培养角质形成细胞形成皮肤样器官

背景:浸没式体外培养角质形成细胞的技术已得较普遍的应用,但角质形成细胞的体外器官样培养技术尚存在不足。目的:以铺有鼠尾胶原的TransWell培养板套皿,提供的气-液交界面体外培养角质形成细胞,以改进角质形成细胞的体外器官样培养技术。设计、时间及地点:体外人工皮肤器官实验,于2008-07/2009-02在河北医科大学第一医院实验室完成。材料:角质形成细胞由解放军第二军医大学王教授馈赠。方法:将浸没式培养的角质形成细胞接种到铺有鼠尾胶原的Transwell培养板套皿当中,Transwell培养板套皿每板有6个孔,每孔当中有一插件,插件悬挂于孔的边缘上,插件底面为一孔径为0.4μm的高分子膜,距离培养板孔的底面有1.5mm的高度,使细胞处于气-液交界面上并培养4周,然后将不同培养时段的培养物进行苏木精-伊红染色、免疫组织化学、流式细胞仪检测,进而观察细胞分层和分化的状况。主要观察指标:观察细胞的生长状态及分层和分化状态。结果:培养2周的角质形成细胞大部分为单层结构,细胞彼此衔接成铺路石状结构,多数细胞为三角形或多角形结构,细胞核清晰可见,细胞比较饱满。部分区域细胞出现双层结构,表现为单层的角质形成细胞上面铺有连接成条索状的细胞。3周的角质形成细胞大部分为双层结构,异层及同层细胞之间彼此衔接,呈索形结构,细胞核仍然清晰可见,细胞不如2周时饱满。4周的角质形成细胞部分区域为三层结构,且细胞较前变得萎缩,表现为细胞浆减少,细胞核变小。角质形成细胞进行气-液交界面培养至4周,细胞会分为3层,表层的细胞会表达终末分化的标志物角蛋白10。结论:在Transwell培养板套皿膜上,角质形成细胞会出现分层和分化,形成体外的皮肤样器官。

猪肺炎支原体不同毒力菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤差异与机制分析

为更真实地探究猪肺炎支原体(Mhp)不同毒力菌株对猪气管上皮细胞(STEC)的致病性差异与机制,通过气液界面培养技术(ALI),建立了传代STEC细胞系3D分化培养模型及Mhp在此细胞上的感染模型。将相同剂量的Mhp强毒株NJ株、中等毒力菌株AH株和弱毒株168L株分别感染3D培养的猪气管上皮细胞,分别通过单层细胞跨膜电阻检测、Alamar Blue检测、乳酸脱氢酶(LDH)释放检测等试验测定细胞单层完整性与细胞活性,并通过激光共聚焦和荧光分光光度计测定感染后48h的细胞MUC5B黏液蛋白的分泌量,从细胞生长特性、活性和黏液分泌功能方面比较不同毒力Mhp菌株感染对STEC分化细胞的影响。研究还从细胞氧化系统方面,比较检测各感染组细胞内NO和内源性ROS分泌量,进一步探索Mhp的致病机制。结果表明:强毒株NJ株和中等毒力AH株组纤毛有明显的变粗、破损和脱落现象,而弱毒株168L株组对纤毛的影响较小;Mhp菌株感染后细胞单层跨膜电阻显著下降,且电阻下降程度与菌株毒力呈正相关。Alamar Blue检测试验、乳酸脱氢酶(LDH)释放检测结果均表明,Mhp NJ株与AH株感染后均可以显著降低细胞活性,且在感染后48h最明显。Mhp菌株感染后还可促进分化细胞分泌MUC5B黏蛋白,菌株毒力越强,刺激黏蛋白分泌的量也越多。氧化应激检测结果显示,除Mhp弱毒菌株168L株外,中等毒力菌株AH株和强毒株NJ株感染3D分化的STEC细胞后,可显著刺激细胞分泌NO和内源性ROS,显著引起细胞的氧化应激反应。而经NAC抗氧化处理后,强毒株NJ株、中等毒力AH株和弱毒株168L株组细胞ROS和黏液分泌量均显著降低,细胞活性和电阻值均显著升高。本研究通过更接近体内环境的3D分化细胞感染模型证明,Mhp感染可对宿主细胞的生长特性与活性产生损伤,且损伤的程度与毒力呈正相关;而这种损伤机制与Mhp菌株引起感染细胞氧化应激的能力密切相关。