小鼠原代气道上皮基底细胞分离、增殖与气液界面培养诱导的定向分化

目的探究小鼠原代气道上皮基底细胞分离、增殖和气液界面(ALI)培养诱导定向分化的方法。方法无菌获取小鼠气管,改良酶消化法分离基底细胞,免疫荧光鉴定。细胞传代,倒置显微镜观察细胞增殖生长,免疫荧光检测KRT5表达水平。气液界面(ALI)培养,HE染色、扫描电镜观察定向分化情况。结果改良酶消化法及增殖培养基培养,可分离基底细胞,免疫荧光检测KRT5阳性。基底细胞增殖效果好,已传至第八代(P8),但P5以后,细胞老化增多,免疫荧光强度变弱。ALI培养诱导的定向分化,HE染色观察P1~P3细胞层多、且高,P1~P4游离面可见纤毛;扫描电镜观察P1~P4细胞游离面特化结构数量多,P5~P8细胞游离面特化结构少。结论该方法可分离纯度、活性均高的基底细胞,并可传代增殖培养,P4之前基底细胞增殖和定向分化效果好,为进一步研究体外气道重塑相关实验提供了细胞支撑。

Calu-3细胞气液界面培养及暴露研究的初探

目的探索Calu-3细胞气液界面(air-liquid interface,ALI)培养条件,及其在暴露系统中暴露洁净空气的耐受性。方法在Calu-3细胞3阶段培养:培养瓶扩增、液液培养至长满Transwell膜、ALI培养后,通过细胞跨上皮电阻(trans-epithelium electrical resistant,TEER)的测定和紧密连接蛋白ZO-1的表达来确定细胞屏障状态;利用气液界面暴露系统将Calu-3细胞暴露在洁净空气中,暴露1、2、3、4、5、6 h,以培养箱培养的细胞作为对照,检测暴露后Calu-3细胞的活性、TEER的变化,确定基于ALI培养的Calu-3细胞在体外暴露系统中的单次最长暴露时间。结果Calu-3细胞液液培养(8±1)d长满Transwell膜,屏障形成,转为ALI培养,在ALI培养的1~18 d内屏障完整,状态稳定,可以用于暴露实验;Calu-3细胞的活性在洁净空气暴露6 h之后明显下降(P<0.01),TEER在洁净空气暴露4、5、6 h之后明显下降(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。结论ALI培养1~18 d的Calu-3细胞可以用于气液界面暴露实验;综合细胞活性和TEER的变化,Calu-3细胞在暴露系统中暴露洁净空气的单次最长暴露时间为3 h。

人气管上皮细胞气液界面无血清培养

用低温酶消化法分离人气管上皮细胞，具有细胞损伤小，活力及纯度高的优点，成纤维细胞污染低。 人胎盘胶原提高了气管上皮细胞的贴壁性。无血清培养基能促进入气管上皮细胞增殖，分化和成熟。气液界 面培养方式更好地模拟了气管上皮细胞的天然生长环境，细胞在膜上呈复层生长，有利于其分化成熟及功能 表达。光镜下细胞形态及免疫组化角蛋白染色阳性证实培养细胞为气管上皮细胞。本文所建立的人气管上皮 细胞体外气液界面无血清培养方法为研究气管上皮细胞的生理和病理提供了一个十分有用的模型。

利用气液界面无血清培养原代兔气管上皮细胞的研究

用低温酶消化法分离兔气管上皮细胞,具有细胞损伤小,活力及纯度高的优点,成纤维细胞污染极低。人胎盘胶原提高了气管上皮细胞贴壁性。无血清培养基能促进细胞增殖,分化和成熟。气液界面培养方式更好地模拟了气管上皮细胞的天然生长环境,在膜上呈复层生长,有利于细胞的分化成熟及功能表达。光镜下细胞形态及免疫组化细胞角蛋白染色阳性证实培养细胞为气管上皮细胞。本文所建立的兔气管上皮细胞体外气液界面无血清培养方法为研究气 管上皮细胞的生理和病理提供了一个十分有用的模型。

在铺有鼠尾胶原的TransWell培养板套皿气-液交界面培养角质形成细胞形成皮肤样器官

背景:浸没式体外培养角质形成细胞的技术已得较普遍的应用,但角质形成细胞的体外器官样培养技术尚存在不足。目的:以铺有鼠尾胶原的TransWell培养板套皿,提供的气-液交界面体外培养角质形成细胞,以改进角质形成细胞的体外器官样培养技术。设计、时间及地点:体外人工皮肤器官实验,于2008-07/2009-02在河北医科大学第一医院实验室完成。材料:角质形成细胞由解放军第二军医大学王教授馈赠。方法:将浸没式培养的角质形成细胞接种到铺有鼠尾胶原的Transwell培养板套皿当中,Transwell培养板套皿每板有6个孔,每孔当中有一插件,插件悬挂于孔的边缘上,插件底面为一孔径为0.4μm的高分子膜,距离培养板孔的底面有1.5mm的高度,使细胞处于气-液交界面上并培养4周,然后将不同培养时段的培养物进行苏木精-伊红染色、免疫组织化学、流式细胞仪检测,进而观察细胞分层和分化的状况。主要观察指标:观察细胞的生长状态及分层和分化状态。结果:培养2周的角质形成细胞大部分为单层结构,细胞彼此衔接成铺路石状结构,多数细胞为三角形或多角形结构,细胞核清晰可见,细胞比较饱满。部分区域细胞出现双层结构,表现为单层的角质形成细胞上面铺有连接成条索状的细胞。3周的角质形成细胞大部分为双层结构,异层及同层细胞之间彼此衔接,呈索形结构,细胞核仍然清晰可见,细胞不如2周时饱满。4周的角质形成细胞部分区域为三层结构,且细胞较前变得萎缩,表现为细胞浆减少,细胞核变小。角质形成细胞进行气-液交界面培养至4周,细胞会分为3层,表层的细胞会表达终末分化的标志物角蛋白10。结论:在Transwell培养板套皿膜上,角质形成细胞会出现分层和分化,形成体外的皮肤样器官。

培养的兔羊膜上皮细胞构建角膜表层移植片的研究

目的应用培养的兔羊膜上皮细胞(AECs)体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,探讨利用AECs重建角膜表层的可行性。方法取妊娠晚期新西兰大白兔(27～28孕周)的羊膜,制成AECs单细胞悬液,用含血清和表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12培养液培养、传代,利用免疫组织化学单克隆抗体AE1/AE3、AE5检测培养的AECs中细胞角蛋白ck3/12的表达;将体外培养的2～3代兔AECs种植在新鲜兔角膜基质上,利用气-液界面培养法使之复层化,体外构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料,进行光学显微镜和扫描电镜观察,并进行免疫组织化学测定。结果体外培养的兔AECs呈现单克隆抗体AE1/AE3、AE5表达阳性,AECs在新鲜兔角膜基质上能形成形态类似于正常角膜上皮细胞的3～5层复层结构,且复层化后的上皮细胞单克隆抗体AE5表达阳性。结论应用培养的AECs能成功构建类似角膜表层的复层上皮细胞-角膜基质移植材料,AECs可能成为重建角膜表层的一种新的细胞来源。

猪肺炎支原体不同毒力菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤差异与机制分析

为更真实地探究猪肺炎支原体(Mhp)不同毒力菌株对猪气管上皮细胞(STEC)的致病性差异与机制,通过气液界面培养技术(ALI),建立了传代STEC细胞系3D分化培养模型及Mhp在此细胞上的感染模型。将相同剂量的Mhp强毒株NJ株、中等毒力菌株AH株和弱毒株168L株分别感染3D培养的猪气管上皮细胞,分别通过单层细胞跨膜电阻检测、Alamar Blue检测、乳酸脱氢酶(LDH)释放检测等试验测定细胞单层完整性与细胞活性,并通过激光共聚焦和荧光分光光度计测定感染后48h的细胞MUC5B黏液蛋白的分泌量,从细胞生长特性、活性和黏液分泌功能方面比较不同毒力Mhp菌株感染对STEC分化细胞的影响。研究还从细胞氧化系统方面,比较检测各感染组细胞内NO和内源性ROS分泌量,进一步探索Mhp的致病机制。结果表明:强毒株NJ株和中等毒力AH株组纤毛有明显的变粗、破损和脱落现象,而弱毒株168L株组对纤毛的影响较小;Mhp菌株感染后细胞单层跨膜电阻显著下降,且电阻下降程度与菌株毒力呈正相关。Alamar Blue检测试验、乳酸脱氢酶(LDH)释放检测结果均表明,Mhp NJ株与AH株感染后均可以显著降低细胞活性,且在感染后48h最明显。Mhp菌株感染后还可促进分化细胞分泌MUC5B黏蛋白,菌株毒力越强,刺激黏蛋白分泌的量也越多。氧化应激检测结果显示,除Mhp弱毒菌株168L株外,中等毒力菌株AH株和强毒株NJ株感染3D分化的STEC细胞后,可显著刺激细胞分泌NO和内源性ROS,显著引起细胞的氧化应激反应。而经NAC抗氧化处理后,强毒株NJ株、中等毒力AH株和弱毒株168L株组细胞ROS和黏液分泌量均显著降低,细胞活性和电阻值均显著升高。本研究通过更接近体内环境的3D分化细胞感染模型证明,Mhp感染可对宿主细胞的生长特性与活性产生损伤,且损伤的程度与毒力呈正相关;而这种损伤机制与Mhp菌株引起感染细胞氧化应激的能力密切相关。

一种基于A549细胞与内皮细胞共培养的新型气液培养模型的建立

目的通过气-液界面(ALI)培养技术将人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549与内皮细胞共培养,探究内皮细胞存在条件下A549细胞表型和功能的变化。方法基于transwell培养体系建立气液共培养模型,A549细胞接种于transwell膜上表面,内皮细胞接种于transwell膜下表面,实时定量PCR(RT-qPCR)检测A549细胞经过传统ALI培养和ALI与内皮细胞共培养后的肺表面活性蛋白、细胞间连接以及与新冠病毒入侵细胞相关分子的表达,流式细胞术检测新冠病毒S蛋白截短体重组慢病毒的细胞感染率。结果通过比较分析,发现EA.hy926内皮细胞系较原代内皮细胞HUVEC更加适合建立新型ALI共培养模型。A549细胞经过传统ALI培养后肺表面活性蛋白SP-B、SP-D的表达上调,促进上皮钙黏蛋白E、紧密连接蛋白表达,新冠病毒受体神经紧张素1、去唾液酸糖蛋白受体1、含kringle跨膜蛋白1显著上调;而在ALI与内皮细胞共培养体系中,上述基因的上调更加显著(P<0.05),模型病毒粒子感染率较传统ALI培养的A549细胞显著上升(P<0.05)。结论成功构建A549细胞和EA.hy926内皮细胞共培养模型,为相关肺部疾病病理研究和药物筛选提供了新的研究模型。

2种气管黏膜上皮细胞体外培养技术的研究

目的为以猪气管黏膜上皮为细胞模型的研究奠定物质基础,进一步探讨猪气管黏膜上皮细胞的体外传统培养和气液界面培养技术,从而使2种培养技术优势互补。方法对猪气管上皮分离、纯化、培养和传代,并探索上皮细胞最佳冻存复苏条件;复苏后的气管上皮细胞进行气液界面培养,绘制细胞生长曲线和观察细胞纤毛生发情况。利用免疫组化法鉴定上皮细胞。结果4步纯化法可以得到高纯度的气管上皮细胞。使用胎牛血清、DMEM/F12培养液和DMSO的体积分数为50%、40%和10%的冻存体系保存的气管上皮,复苏后细胞存活率平均可达89%。优化后的传统方式培养的上皮细胞可连续传代到第8代,但从第2代开始便观察不到纤毛,转换成气液界面连续培养2代后重新生发纤毛,细胞存活期延长。免疫组化结果显示分离培养细胞为上皮细胞。结论成功建立了2种猪气管上皮细胞培养技术,并找到适宜的气管上皮细胞冻存条件,节省了不断原代取材的成本和时间,并成功实现传统培养细胞冻存复苏后很快适应气液界面的培养并恢复细胞的天然结构,为猪气管黏膜上皮相关研究提供丰富的细胞来源。

人脐血干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞

背景:鼻黏膜纤毛上皮细胞受损后导致鼻黏膜生物功能严重创伤。相对于其他成体干细胞,人脐血干细胞具有更好的诱导分化潜能。目的:观察人脐血干细胞通过体外培养、诱导分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞的可行性。方法:收集正常健康人脐血,分离人脐血干细胞,通过体外培养,鉴定干细胞表面标记物后进行传代培养;取第3代脐血干细胞,用携带增强型绿色荧光蛋白重组腺相关病毒进行感染,采用气液界面培养法,分别于诱导感染1,2周后对干细胞进行MUC8基因PCR检测。在脐血干细胞培养3周后进行FOXJ1免疫荧光染色。结果与结论:(1)培养鉴定结果:原代人脐血干细胞传代至第3代时,细胞形态较均一,折光性良好,可表达干细胞表面标记物;(2)转染鉴定结果:细胞转染3 h后,可见第3代干细胞呈现出绿色荧光,培养48 h后,流式细胞仪检测细胞阳性率达96.2%,说明干细胞转染效果很好;(3)RT-PCR检测:人脐血干细胞MUC8 m RNA无表达,而鼻黏膜上皮细胞MUC8 m RNA呈现出强表达,培养1周时MUC8mRNA呈现弱表达,培养2周后有一定的增强;(4)免疫荧光染色:在转染的绿色荧光蛋白背景下可观测到FOXJ1红色荧光呈现阳性表达结果;(5)结果说明:人脐血干细胞在适宜培养条件下可分化为鼻黏膜纤毛上皮细胞。

毛乳头细胞体外诱导毛囊上皮细胞分化的实验研究

目的:探讨间质细胞对毛囊上皮细胞分化的调节作用,研究毛囊上皮细胞的分化特性。方法:分别用团块状的毛乳头细胞、皮肤成纤维细胞制成间质细胞胶原凝胶,表面接种毛囊上皮细胞,进行气-液界面培养。结果:毛囊上皮细胞有向毛乳头细胞移动集结的趋势;团块状的毛乳头细胞诱导毛囊上皮细胞形成球形结构;皮肤成纤维细胞诱导毛囊上皮细胞形成表皮样层化结构。结论:(1)毛囊上皮细胞具有双向分化特性,它既能分化形成毛囊,也能分化形成表皮结构;(2)毛乳头细胞对毛囊上皮细胞有趋化作用;(3)间质细胞的种类及分布在毛囊上皮细胞分化的调节中起着重要的作用。

呼吸道上皮细胞模型的研究进展

呼吸道病毒严重威胁人类的健康。呼吸道上皮细胞是机体防御呼吸道病毒和细菌等外来病原体的第一道防线,因此建立呼吸道上皮细胞体外分化模型,为研究呼吸系统疾病发病机理、筛选有效的治疗药物奠定基础。本文主要介绍人呼吸道上皮细胞原代培养技术的研究进展及其在呼吸道病毒和呼吸系统疾病方面的应用。

猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究

猪是许多呼吸道病毒感染的天然宿主,其与人类在肺生理学、呼吸道形态学和呼吸道细胞类型以及受体分布都有相似之处。为了解呼吸道病毒感染机制和筛选呼吸系统疾病药物,选择以猪肺组织为原料采用无血清气液界面培养法构建一种猪呼吸道上皮细胞(Porcine airway epithelial cell,PAEC)体外分化模型,然后通过扫描电子显微镜、电生理和免疫组织化学等方法鉴定该模型。采用三质粒共转染法构建重组腺相关病毒rAAV6-GFP(rAAV6-green fluorescent protein,rAAV6-GFP),通过顶端表面感染PAEC模型,探讨AAV6在PAEC模型中基因治疗领域的应用。结果显示分化成熟的PAEC模型为多层上皮结构,顶端表面含有纤毛细胞、黏液分泌细胞和基底细胞。rAAV6-GFP能通过顶端表面感染PAEC,有效地介导外源基因的长期表达。本文建立的猪呼吸道上皮细胞体外分化模型为呼吸道病原体感染和呼吸系统疾病药物筛选和基因疗法等研究奠定了良好的基础。