嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与序列分析

以嗜水气单胞菌BZ和NK分离株的DNA为模板，采用PCR技术，扩增气溶素基因（aerA）的DNA片段，将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定，分析结果表明-所克隆的1393bp片段为aerA部分序列，编码产生464个氨基酸。BZ与NK之间aerA核苷酸同源性为97．6％，氨基酸同源性为98．3％，与其它分离物核苷酸同源性为71．6％～97．5％，氨基酸同源性为68．0％～98．9％。利用邻接法构建了aerA分子树状图，树状图分析表明：气单胞菌属各分离物聚为三支，其中嗜水气单胞菌各菌株之间关系密切，被聚类为同一支。

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

[目的]建立一种基于PCR的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。[方法]采用平板划线法从患病鲫鱼病灶部位分离、纯化获得嗜水气单胞菌,采用CTAB法提取DNA,根据GenBank已经登录的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因保守序列设计引物P1和P2,并以P1、P2为引物对其进行PCR扩增,将测序结果在Blast上进行比对分析。[结果]PCR扩增得到一条约540 bp的条带,Blast分析表明该基因与GenBank登录的气溶素基因的同源性达95.67%。[结论]试验建立的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法简单、可行。

不同动物源性维氏气单胞菌气溶素基因的克隆及比较分析

为系统研究维氏气单胞菌毒力因子气溶素,对不同动物源性的维氏气单胞菌气溶素基因(aerA)进行了克隆,获得了1500 bp左右的目的基因,并对其序列进行了分析比较。结果显示,不同动物源性维氏气单胞菌aerA基因的核苷酸序列均具有APT Superfamily与Aerolysin Superfamily保守结构域,其核苷酸序列的同源性在95.8%以上,编码的氨基酸序列同源性在89.8%以上,说明不同源性维氏气单胞菌气溶素具有一定的保守性。该研究结果可为维氏气单胞菌的检测及疫苗制备提供一定的理论依据。

林蛙嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆及原核表达

以长白山林蛙中分离的嗜水气单胞菌为材料,对嗜水气单胞菌气溶素基因进行克隆、序列分析及基因表达等研究,为嗜水气单胞菌的分子生物学研究提供依据。通过实验成功克隆了气溶素基因,大小为1163bp,对其进行同源性检测,与基因库中DQ186611基因序列的同源性高达99%;构建原核表达重组质粒pGEX-Aer,在大肠杆菌BL21中获得表达,蛋白分子量约为69ku,以包涵体形式存在。

嗜水气单胞菌气溶素基因克隆与蛋白结构预测

目的:对嗜水气单胞菌气溶素(Aer)基因进行克隆、序列分析及蛋白三级结构(3D结构)预测。方法:利用PCR方法扩增嗜水气单胞菌Zf1菌株的Aer基因,进行生物信息学分析。结果:获得Aer基因长1 479bp,推导编码493aa,预测Aer蛋白抗原表位位于44-48、230-236、355-361、370-374和447-459,并含有APT结构域(PF03440)、Aer结构域(PF01117),以及2个高度保守序列SYLAHYLGYAWVGG(140-153)和GFLRWGGNAW(343-352)。Aer蛋白的3D结构与模板(PDB:3G4O_B)相似性达93.79%,其中气溶素生理活性相关亚单位(PS50233)构成Aer的核心区,抗原表位(447-459)位于C端外侧表面,并与拉马钱德兰图检测分析Aer蛋白的空间结构基本一致。结论:对嗜水气单胞Zf1菌株Aer基因编码蛋白分子进行结构和功能分析,有助于理解其致病机理,为进一步验证Aer生物学特性提供科学参考。

罗非鱼嗜水气单胞菌气溶素毒素基因的克隆及功能分析

根据已发表的嗜水气单胞菌气溶素(Aer)毒素基因的序列,设计1对特异性引物,应用PCR技术,扩增GXL3、GXL5、GXL9共3株罗非鱼嗜水气单胞菌的气溶素成熟蛋白基因,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,3个菌株Aer毒素成熟蛋白的核苷酸序列为1335bp,编码445个氨基酸,其与分离株No.BAA83088的成熟蛋白基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为90.9%、91.4%、91.4%和96.2%、96.6%、96.6%,具有很高的同源性。应用分子生物软件分析广西分离株GXL9 Aer成熟蛋白,该蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,等电点为5.5。

PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌

根据已发表的气单胞菌16SrDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列,设计了2对引物,建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测,发现16SrDNA引物具有高度的特异性,仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97.2%,且具有高度的敏感性,可检测最低1fg的模板。将16SrDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94.4%。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。

鲢鳙鱼源致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定

从江西省南城县和广东省佛山市、韶关市患细菌性败血症病鲢鱼、鳙鱼体内分离到3株优势菌,人工感染鲢后证实为该病的病原菌,此3株菌对剑尾鱼的半致死量(LD50)分别为:2.64×105、9.24×104、4.45×105CFU/g。对3株病原菌进行形态特征、ATB细菌鉴定仪生理生化特性鉴定结果符合嗜水气单胞菌的特征;为进一步确定病原菌分类地位,对其16SrRNA序列扩增测序,并与相关细菌16SrRNA序列比对,构建系统发育树,在系统发育树中与嗜水气单胞菌聚类为一支。Aero气溶素基因PCR扩增出209bp条带,检测结果进一步表明此3株菌为含有毒力基因的致病性嗜水气单胞菌。

辽宁地区养殖淡水鱼感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

通过RS选择性培养基和针对16S rDNA与气溶素基因的双重PCR检测技术,对采集于辽宁省不同地区、不同鱼类、不同症状病鱼感染的嗜水气单胞菌进行了系统的流行病学调查,并对致病性嗜水气单胞菌进行了毒力验证试验及对抗菌药物的敏感性试验。结果发现,51株临床样本中有26株分离菌扩增得到685 bp大小的目的片段,证明为嗜水气单胞菌,占分离细菌总数的50.98%,占绝对的优势,其中以出血症状为主的病鱼分离的菌占23.99%,以肠炎为主症状的病鱼分离菌占17.99%,以烂鳃症状为主病鱼分离菌占9%。26株嗜水气单胞菌中有17株同时扩增出252 bp大小的气溶素基因(aerA),表明这17株分离菌为致病性嗜水气单胞菌。人工感染试验结果表明,致病性嗜水气单胞菌均有毒力且毒力大小差异明显。药敏实验结果显示,嗜水气单胞菌不同分离株对抗生素的敏感性差异很大,对先锋V耐药率高达90%,对新生霉素、红霉素、利福平、四环素耐药率也相对较高,分别为56.2%,42.7%,37.5%,31.1%,而对氟哌酸、链霉素、庆大霉素则较敏感。该结果对建立片区病原库,揭示辽宁地区淡水养殖鱼类感染的嗜水气单胞菌的地理分布、毒力大小、耐药性差异,进而弄清嗜水气单胞菌的表型、基因型差异具有重要理论参考意义。

嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank收录的细胞兴奋性肠毒素(alt)基因和气溶素结构基因(aerA),依据嗜水气单胞菌保守序列分别设计能检测alt和aerA基因的特异性引物,并进行PCR反应体系和反应条件的优化。建立了一种快速检测嗜水气单胞菌双重PCR方法。结果显示,在同一PCR反应体系中,供试菌株嗜水气单胞菌扩增2条目的带,扩增产物的片段大小分别为200bp和280bp,而对照菌株温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、河流弧菌的PCR扩增则无条带检出。敏感性试验结果显示,该双重PCR最低能检测3×104cfu/mL菌体密度的嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌模板DNA的检出极限为49fg/μL;同时对送检的患病水产品进行抽检,检测出阳性结果的样品均可分离到优势生长的嗜水气单胞菌。结果证实,试验所建立的基于2种基因的双重PCR方法快捷、灵敏,为今后由于该菌所引起的水产动物疾病的检测提供了参考依据。

嗜水气单胞菌实时荧光三重TaqMan PCR快速检测体系的建立

目的建立针对嗜水气单胞菌的高灵敏、高特异的实时荧光三重TaqMan聚合酶链式反应(PCR)快速检测体系。方法根据嗜水气单胞菌的16SrDNA、气溶素基因(aerA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahp)的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用29种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性。结果实时荧光三重TaqMan PCR快速检测体系对嗜水气单胞菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对嗜水气单胞菌基因组的检测灵敏度为5×10-2pg/反应体系;该体系的特异性引物探针在检测29种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现假阳性,整个反应在2h内完成。结论本研究建立的实时荧光三重TaqManPCR检测体系可作为嗜水气单胞菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时评价嗜水气单胞菌的致病潜力。

嗜水气单胞菌Lamp检测方法的建立及应用

基于嗜水气单胞菌气溶素（aerolysin）基因的序列，设计了1套引物，通过条件优化，成功建立了针对致病性嗜水气单胞菌的环媒恒温基因扩增（Lamp）检测法。采用Lamp法对病原菌进行了扩增，并对病鱼血样进行了检测。结果表明，该法只检出致病性嗜水气单胞菌。对不同浓度的细菌悬液扩增结果表明，Lamp检测嗜水气单胞菌的最低菌液浓度为1．4～14／μL。

框镜鲤致病性维氏气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测框镜鲤致病性维氏气单胞菌(A.veronii)双重PCR方法,本研究以A.veronii CY0806株和国际标准株DNA为模板,分别以16S rRNA和Aer基因特异性引物进行PCR扩增,分别获得大小约880 bp和430 bp的DNA片段。通过序列比对分析,16S rRNA基因片段、Aer片段序列与GenBank中登录的A.veronii ATCC35624株的的同源性均为99%。进一步试验显示该方法的敏感性较高,达到1.58×10-3ng/μL,特异性较强,只有A.veronii标准株及分离株结果呈阳性;人工模拟污染样本试验显示:该方法的检出率达到了86.7%,高于细菌分离培养的70%检出率。双重PCR检测方法的建立,为框镜鲤致病性A.veronii的检测提供新的方法。

MGB探针实时定量PCR检测致病性嗜水气单胞菌

以嗜水气单胞菌气溶素(aerolysin)基因为待检靶基因,设计一对引物和一条MGB(M inor Groove B inder)探针,Aero基因探针5′端用FAM基团标记,3′端用TaqMan-MGB标记。建立并优化了检测嗜水气单胞菌荧光定量PCR方法,可检测的最低细菌数为1.25×100CFU/μl;试验中嗜水气单胞菌检测结果均为阳性,而非嗜水气单胞菌检测结果均为阴性;重复性试验中,批间差异小于5%,批内差异小于3%。试验结果显示,荧光定量PCR方法可对致病性嗜水气单胞菌株进行快速鉴定。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径,是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。

大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断方法的建立

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌气溶素基因(hlyA)序列,设计1对特异性引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断方法。结果表明:扩增的阳性条带约为600 bp,特异性、敏感性结果显示,该PCR方法对致病性嗜水气单胞菌DNA的最低检测量为0.4 ng/L,而非致病性嗜水气单胞菌、大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌的扩增结果均为阴性。对123份大鲵病料进行检测,结果建立的PCR方法检测结果与细菌学和生化检验结果符合率为97.6%,表明该PCR方法能够对大鲵致病性嗜水气单胞菌样品进行快捷、灵敏、准确的检测。

27株嗜水气单胞菌致病性及ERIC-PCR指纹图谱分析

从福建省淡水养殖鱼类体内分离到27株嗜水气单胞菌,根据嗜水气单胞菌16S rDNA基因和气溶素基因(aerolysin)的保守序列,设计2对引物,对所分离到的27株嗜水气单胞菌进行双重PCR扩增,扩增结果表明,其中18株为含有Aer毒力基因的潜在致病性嗜水气单胞菌,占总菌数的66.67%。应用ERIC—PCR分型技术对27株嗜水气单胞菌菌株进行分析,以相似度54.00%为限,所有菌株可分为Ⅰ和Ⅱ两大聚类,以76.00%相似度为界,27株嗜水气单胞菌可分为11个聚类,同一个聚类中菌株分离区域基本相同。分析结果表明,分离的嗜水气单胞菌基因型的多样性和分离地域具有一定的关联,也表明ERIC—PCR可以有效应用于嗜水气单胞菌分子流行病学调查。

应用PCR快速诊断黄鳝嗜水气单胞菌败血症

根据致病性嗜水气单胞菌的标志性毒力基因-气溶素(aerolysin)基因序列,设计出一对特异性引物,采用PCR方法,对22尾临床疑似患嗜水气单胞菌败血症的黄鳝进行了诊断,检测出其中17尾呈致病性嗜水气单胞菌阳性,检测过程仅需6h;而常规细菌分离鉴定则耗时72h,检出率仅为9/22。

嗜水气单胞菌气溶素毒力基因检测研究

目的对嗜水气单胞菌气溶素基因进行检测并分析其携带率。方法采用常规法从三角帆蚌体内分离嗜水气单胞菌并鉴定,PCR法扩增气溶素毒力基因,计算其携带率。结果5株嗜水气单胞菌携带aer毒力基因,携带率为50%。结论气溶素基因是嗜水气单胞菌的重要毒力因子。

草鱼出血病混合感染的嗜水气单胞菌的分离、鉴定与理化特性

从患出血病草鱼的肝脏病灶中分离筛选出2株致病菌。取病鱼样品组织过滤液接种CIK细胞、培养,电镜下观察到细胞质中含有草鱼呼肠孤病毒样颗粒和包涵体,病毒颗粒大小65nm～70nm,包涵体0.46μm～1.81μm。人工回归感染实验显示分离的菌株及细胞毒悬液均能使草鱼致病死亡。对分离菌株进行细胞形态学、理化特性分析及药敏试验,初步判定所分离的2株菌均为嗜水气单胞菌。进一步对菌株进行DNA分子鉴定,结果显示2株菌的16SrRNA基因、促旋酶亚单位蛋白(gryB)基因均与GenBank上的嗜水气单胞菌相应的基因具有较高的同源性。在根据已知序列分别构建的2个基因的分子系统进化树中2株菌均与嗜水气单胞菌聚类。同时2个菌株均可扩增到气溶素基因(aerA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahpA),提示它们均可能为嗜水气单胞菌强毒株。综合人工回归感染实验与毒力基因鉴定结果可认为所分析的草鱼出血病病例存在着病毒与嗜水气单胞菌的混合感染。

大鲵致病性嗜水气单胞菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌特异性的气溶素基因序列,设计1对引物,利用普通PCR技术扩增获得hlyA基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件的优化,建立了快速检测致病性嗜水气单胞菌的SYBR GreenⅠ荧光定量诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对非致病性嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、迟缓爱德华菌、柱状黄杆菌均无阳性信号扩增,重复性好,灵敏度可达1.0x101拷贝/uL。结果表明研制的致病性嗜水气单胞菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等特点,适合于大鲵临床样品的检测。