猪肺炎支原体乳酸脱氢酶在诱导猪支气管上皮细胞凋亡中的作用

猪肺炎支原体感染会引起宿主上皮细胞的损伤及凋亡。上皮屏障的破坏往往导致细菌和病毒的继发感染,给养猪业造成严重的经济损失,但具体的致病机制及毒力因子尚未完全阐明。前期研究发现猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)不仅参与猪肺炎支原体的代谢还与猪肺炎支原体的毒力相关。因此,本研究通过原核表达及亲和层析获得猪肺炎支原体乳酸脱氢酶重组蛋白(recombinant LDH, rLDH),之后分别用不同浓度的rLDH与猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cell, PBEC)孵育,经显微镜观察rLDH对细胞形态的影响,通过CCK-8法检测rLDH对细胞活力的影响。选取对细胞形态及活力影响不显著的50和100μg·mL^(-1) rLDH分别与PBEC孵育,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,反转录荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法和免疫印记检测凋亡相关基因caspase 3、caspase 8、caspase 9、Bax、BCL-2的转录水平和蛋白水平。结果显示:猪肺炎支原体rLDH呈剂量依赖性地诱导PBEC凋亡,其作用与猪肺炎支原体菌株一致。用rLDH及Mhp 168孵育后,PBEC的促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9的mRNA水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的mRNA水平显著下调,caspase 8的mRNA水平未发生显著变化。促凋亡因子Bax、caspase 3的蛋白表达水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的蛋白表达水平显著下调。结果表明,猪肺炎支原体可能通过LDH诱导PBEC内源性细胞凋亡,凋亡相关因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中发挥重要作用。

安胃汤含药血清对胃黏膜肠上皮化生模型细胞自噬及凋亡的影响

目的探讨安胃汤(半夏、黄连、干姜、乌药、百合等)含药血清对胃黏膜肠上皮化生(Gastric intestinalmetaplasia,GIM)模型细胞自噬及凋亡的影响。方法采用鹅去氧胆酸(CDCA)诱导人胃黏膜上皮细胞GES-1,制备GIM细胞模型。实验分为正常组(正常胃黏膜上皮细胞GES-1常规培养)、模型组(经CDCA复制成GIM模型后常规培养)、空白对照组(GIM模型细胞以等量空白血清培养)、安胃汤组(GIM模型细胞+7%安胃汤含药血清),各组细胞干预24 h后检测。采用流式细胞术(Annexin V-PE/7-AAD双染法)检测细胞凋亡;免疫荧光双标法检测肠上皮化生相关蛋白SOX2、CDX2的表达情况;透射电镜观察细胞超微结构及自噬情况;qRT-PCR法检测细胞LC3、Bax mRNA表达情况;Western Blot法检测细胞MUC2、KLF4、LC3、Bax蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组细胞的MUC2、KLF4蛋白表达显著上调(P<0.01),细胞的凋亡率明显降低(P<0.05);SOX2荧光强度明显降低(P<0.05),CDX2荧光强度显著增高(P<0.01);细胞结构紊乱,细胞核萎缩畸形,内质网和线粒体等细胞器肿胀破裂及空泡化严重,自噬小体及自噬溶酶体明显增多;Bax mRNA及蛋白表达明显下调(P<0.05),LC3 mRNA表达显著上调(P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达比值显著升高(P<0.01)。与空白对照组比较,安胃汤组细胞的凋亡率显著增高(P<0.01);SOX2荧光强度显著增高(P<0.01),CDX2荧光强度明显降低(P<0.05);细胞结构较完整,镜下可见自噬小体和自噬溶酶体略有减少;Bax mRNA及蛋白表达显著上调(P<0.01),LC3 mRNA表达显著下调(P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达比值显著降低(P<0.01)。结论安胃汤可能通过调节GIM模型细胞自噬,并促进其凋亡,从而改善胃黏膜上皮细胞的肠上皮化生情况。

甘草酸抑制呼吸道合胞病毒感染支气管上皮细胞凋亡的机制研究

目的:探讨甘草酸对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的支气管上皮细胞凋亡的影响,分析其机制是否与内源性酪氨酸激酶2(JAK2)/信号传导和转录激活因子3(STAT3)信号通路有关。方法:将HBE细胞分为对照组、感染组(RSV组)、低剂量甘草酸组(RSV+L-甘草酸组)、中剂量甘草酸组(RSV+M-甘草酸组)、高剂量甘草酸组(RSV+H-甘草酸组)、RSV+Colivelin组、RSV+H-甘草酸+SD-1029组。对照组细胞不经任何处理;RSV组用含0.0001 PFU/mL的RSV病毒溶液培养细胞2h,再更换为正常培养液培养24h;RSV+L-甘草酸组、RSV+M-甘草酸组和RSV+H-甘草酸组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用30、60、120μg/mL甘草酸处理的培养基培养的细胞;RSV+Colivelin组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用含有浓度为0.5μmoL/L JAK2/STAT3信号通路激活剂Colivelin处理的培养基培养细胞;RSV+H-甘草酸+SD-1029组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用120μg/mL甘草酸和10μmoL/L JAK2/STAT3信号通路抑制剂SD-1029共同处理的培养基培养细胞。24h后收集细胞,CCK-8试剂盒检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;ELISA检测细胞上清液中IL-6、TNF-α水平;western blot检测细胞中Bax、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达情况。结果:与对照组比较,RSV组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05);与RSV组比较,RSV+L-甘草酸组、RSV+M-甘草酸组、RSV+H-甘草酸组、RSV+Colivelin组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著降低(P<0.05);与RSV+H-甘草酸组比较,RSV+H-甘草酸+SD-1029组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05)。结论:甘草酸可能通过激活JAK2/STAT3信号通路,促进RSV感染的支气管上皮细胞增殖,抑制RSV感染的支气管上皮细胞的凋亡。

LncRNA XIST调节miR-574-5p/TLR4轴对呼吸道合胞病毒感染的支气管上皮细胞凋亡的影响

目的探讨长链非编码(long non-coding,Lnc)核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)X-非活性特异性转录本(X-inactive specific transcript,XIST)调节微小RNA(microRNA,miR)-574-5p/Toll样受体(Toll-like receptor 4,TLR4)轴对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染的支气管上皮细胞凋亡的影响。方法将人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial,16HBE)分为阴性对照(negative control,NC)组、RSV感染(RSV infection,RSV)组、小干扰RNA阴性对照(small interfering RNA negative control,si-NC)组、XIST小干扰RNA(XIST small interfering RNA,si-XIST)组、siXIST+抑制剂阴性对照(inhibitor negative control,inhibitor-NC)组、si-XIST+miR-574-5p抑制剂(miR-574-5p inhibitor)组,实时荧光定量聚合酶链反应检测LncRNA XIST、miR-574-5p表达;5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)染色、流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡;酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β的分泌;双荧光素酶报告基因实验验证miR-574-5p与LncRNA XIST和TLR4的关系;蛋白质印迹检测TLR4、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞抗凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(B lymphoblastoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteine aspartate proteolytic enzyme 3,Cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果相较于NC组,RSV组、si-NC组LncRNA XIST、凋亡率、IL-6、IL-1β、TNF-α水平、TLR4、Bax、Cleaved Caspase-3表达升高,EdU阳性率、miR-574-5p、PCNA、Bcl-2表达降低(P均<0.05);相较于si-NC组,si-XIST组LncRNA XIST表达、凋亡率、IL-6、IL-1β、TNF-α水平、TLR4、Bax、Cleaved Caspase-3表达降低,EdU阳性率、miR-574-5p、PCNA、Bcl-2表达升高(P均<0.05);下调miR-574-5p可逆转敲低LncRNA XIST对RSV感染的16HBE细胞凋亡和炎症反应的抑制(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实miR-574-5p与LncRNA XIST、miR-574-5p与TLR4存在靶向调控关系(P<0.05)。结论LncRNA XIST在RSV感染的16HBE细胞中上调表达,敲低LncRNA XIST可能通过上调miR-574-5p来下调TLR4表达,抑制RSV感染后的16HBE细胞凋亡。

吴茱萸碱对哮喘模型大鼠炎症及上皮细胞凋亡的影响及机制

目的 探究吴茱萸碱对哮喘模型大鼠炎症反应及上皮细胞凋亡的影响及潜在机制。方法 将SD大鼠分为对照组、模型组、吴茱萸碱低剂量组(10 mg/kg)、吴茱萸碱高剂量组(20 mg/kg)、地塞米松组(阳性对照,0.5 mg/kg)、表皮细胞生长因子(EGF)组[丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活剂,10μg]、吴茱萸碱高剂量+EGF组(20 mg/kg吴茱萸碱+10μg EGF),每组10只。除对照组外,其余各组大鼠以10%卵白蛋白(OVA)-氢氧化铝混合液3点注射致敏联合2%OVA雾化液吸入激发的方式建立哮喘模型。检测各组大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞(巨噬细胞、淋巴细胞)数,观察大鼠肺组织的病理变化,检测大鼠肺组织中气道上皮细胞凋亡情况、血清炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素4)水平、通路相关蛋白[p38 MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38 MAPK)、信号转导及转录激活因子1(STAT1)]及凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]的表达水平。结果 与对照组比较,模型组大鼠肺组织可见支气管黏膜水肿、肺泡间隔增厚和大量炎症细胞浸润,炎症细胞数显著增多;气道上皮细胞凋亡率、炎症因子水平、p-38 MAPK/p-38 MAPK和Bax、STAT1蛋白表达水平均显著升高,Bcl-2蛋白表达水平和Bcl-2/Bax均显著降低(P<0.05)。与模型组比较,吴茱萸碱低、高剂量组和地塞米松组大鼠肺组织病理改变均有不同程度缓解,上述各指标均显著逆转,而EGF组上述指标的变化趋势则相反(P<0.05);EGF能显著减弱高剂量吴茱萸碱对哮喘大鼠炎症反应的改善作用(P<0.05)。结论 吴茱萸碱可减轻哮喘大鼠炎症反应并减少气道上皮细胞凋亡,其作用机制可能与抑制p38 MAPK/STAT1信号通路有关。

miR-660-3p靶向NFAM1对RSV诱导支气管上皮细胞凋亡及炎症因子分泌的影响

目的探讨微小RNA-660-3p(miR-660-3p)靶向具有ITAM基序1的NFAT活化蛋白(NFAM1)对呼吸道合胞病毒(RSV)诱导支气管上皮细胞凋亡和炎症因子分泌的影响。方法体外传代培养人支气管上皮细胞16HBE。取对数生长期16HBE细胞,随机分为对照组、RSV组、miR-660-3p+RSV组、miR-NC+RSV组、pcDNA-NC+RSV组、pcDNA-NFAM1+RSV组、miR-660-3p+pcDNA-NC+RSV组、miR-660-3p+pcDNA-NFAM1+RSV组,miR-NC+RSV组转染NC mimics,miR-660-3p+RSV组转染miR-660-3p mimics,pcDNA-NFAM1+RSV组转染pcDNA-NFAM1,pcDNA-NC+RSV组转染pcDNA-NC,miR-660-3p+pcDNA-NC+RSV组共转染pcDNA-NC和miR-660-3p mimics,miR-660-3p+pcDNA-NFAM1+RSV组共转染pcDNA-NFAM1和miR-660-3p mimics,对照组和RSV组不予转染;除对照组外,其余各组均予RSV感染,MOI设定为0.0001。收集各组细胞,采用RT-qPCR法检测miR-660-3p、NFAM1 mRNA表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Western blotting法检测Cleaved-Caspase-3、NFAM1蛋白表达;收集各组培养上清液,采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β。通过starBase数据库预测NFAM1与miR-660-3p的靶向结合位点,并采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-660-3p与NFAM1的靶向调控关系。结果与对照组比较,RSV组miR-660-3p表达降低,NFAM1 mRNA与蛋白及Cleaved-Caspase-3蛋白表达升高,细胞凋亡率及培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P均<0.05)。与miR-NC+RSV组比较,miR-660-3p+RSV组miR-660-3p表达升高,Cleaved-Caspase-3蛋白表达以及细胞凋亡率和培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低(P均<0.05)。与pcDNA-NC+RSV组比较,pcDNA-NFAM1+RSV组NFAM1 mRNA、Cleaved-Caspase-3蛋白表达以及细胞凋亡率和培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P均<0.05)。经starBase数据库预测,NFAM1的3′非翻译区存在与miR-660-3p的结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示,相较于共转染NC mimics与NFAM1-WT的16HBE细胞,共转染miR-660-3p mimics与NFAM1-WT的16HBE细胞荧光素酶活性下降(P<0.05);相较于共转染NC mimics与NFAM1-MUT的16HBE细胞,共转染miR-660-3p mimics与NFAM1-MUT的16HBE细胞荧光素酶活性变化不明显(P>0.05)。与miR-660-3p+pcDNA-NC+RSV组比较,miR-660-3p+pcDNA-NFAM1+RSV组Cleaved-Caspase-3蛋白表达以及细胞凋亡率和培养上清液TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P均<0.05)。结论miR-660-3p可通过靶向负调控NFAM1抑制RSV诱导支气管上皮细胞凋亡及炎症因子分泌。

敲减辅酶Q10B表达对裸鼠食管鳞癌皮下移植瘤细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的影响

目的探讨敲减辅酶Q10B(COQ10B)表达对裸鼠食管鳞状细胞癌(鳞癌)皮下移植瘤细胞增殖、凋亡及上皮间质转化(EMT)的影响。方法利用慢病毒转染技术将COQ10B的干扰慢病毒及其阴性对照转染至食管鳞癌细胞(KYSE150细胞)中,构建敲减COQ10B表达的KYSE150细胞(sh-COQ10B组)和阴性对照KYSE150细胞(sh-NC组)。选择雌性BALB/c裸鼠20只,随机分入sh-COQ10B组和sh-NC组各10只,分别于裸鼠右前肩胛处皮下接种转染sh-COQ10B和sh-NC的KYSE150细胞,以此构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察接种后不同时间皮下移植瘤生长情况并测量瘤体的体积和质量。接种第26天实验结束后取瘤体组织,采用HE、免疫组化、TUNEL染色法观察裸鼠皮下移植瘤中细胞增殖和凋亡的情况,以Westernblotting法检测移植瘤中EMT相关蛋白(E-cadherin和Vimentin)和凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)表达。结果与sh-NC组比较,sh-COQ10B组中COQ10B蛋白表达量低(P<0.05);皮下移植瘤模型构建成功且裸鼠均无死亡。sh-COQ10B组移植后不同时间瘤体体积和质量均小于sh-NC组(P均<0.05)。与sh-NC组比较,sh-COQ10B组肿瘤细胞凋亡率高,瘤体组织内Bcl-2、Vimentin蛋白表达低,Bax、E-cadherin表达高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论敲减COQ10B表达可抑制裸鼠食管鳞癌皮下移植瘤细胞增殖和EMT的发生,促进肿瘤细胞凋亡。

芒柄花素调节Hippo/YAP信号通路对炎症性肠病大鼠肠上皮细胞凋亡的影响

目的 探究芒柄花素(FMN)对炎症性肠病(IBD)大鼠肠上皮细胞凋亡的影响及可能机制。方法 采用三硝基苯磺酸诱导的方法构建大鼠IBD模型。将造模成功的48只大鼠按照随机数字表法分为模型组(生理盐水),低、高剂量FMN组(20、40 mg/kg FMN)和高剂量FMN+YAP抑制剂Verteporfin(VTPF)组(40 mg/kg FMN+10 mg/kg VTPF),每组12只;另取12只大鼠设为正常组(生理盐水);每天给药/生理盐水1次,连续7 d。末次给药后,对大鼠疾病活动指数(DAI)进行评分;测量大鼠结肠长度;观察大鼠结肠组织的病理学变化;检测大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10水平;检测大鼠肠上皮细胞的凋亡情况;检测大鼠结肠组织中Yes相关蛋白(YAP)、切割型胱天蛋白酶3(cleaved-caspase-3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。结果 与正常组比较,模型组大鼠DAI评分,TNF-α、IL-6水平,肠上皮细胞凋亡率,cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);结肠长度显著变短(P<0.05);IL-10水平和YAP、Bcl-2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);结肠组织出现细胞形态异常、排列紊乱,炎症细胞浸润等病理学变化。与IBD组比较,低剂量FMN组、高剂量FMN组大鼠上述指标水平均显著改善(P<0.05),且具有剂量依赖性(P<0.05);而加入VTPF后,显著逆转了FMN对IBD大鼠上述指标的改善作用(P<0.05)。结论 FMN可能是通过抑制Hippo/YAP信号通路,促进YAP的表达,进而抑制IBD大鼠肠上皮细胞凋亡。

基于METTL3介导的miR-29a-3p的m^(6)A修饰探讨平喘颗粒抑制气道上皮细胞泛凋亡治疗哮喘的机制研究

目的:观察平喘颗粒对METTL3介导的气道上皮细胞中miR-29a-3p的m^(6)A修饰的影响,明确其抑制哮喘气道炎症的分子机制。方法:16HBE采用LPS诱导(50 mg/L)构建细胞模型,并给予平喘颗粒含药血清和地塞米松进行干预。分别采用CCK8法检测细胞活性、ELISA法检测炎症因子(TNF-α、IL-6和IL-8)的含量和miR-29a-3p的m^(6)A修饰水平、Western blot检测METTL3与泛凋亡蛋白的表达和qRT-PCR检测METTL3与miR-29a-3p的表达。结果:与模型组相比,平喘颗粒能够显著增加16HBE的活力,抑制炎症因子TNF-α、IL-6和IL-8的含量,下调泛凋亡相关蛋白p-RIPK3、p-MLKL、cleaved Caspase-1、cleaved Caspase-3的表达和GSDMD-NT/FL-GSDMD与GSDME-NT/FL-GSDME的比值,差异均具有统计学意义(P<0.01)。此外,平喘颗粒能够显著上调细胞中miR-29a-3p和METTL3的表达水平,促进miR-29a-3p的m^(6)A修饰水平,与模型组相比差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:平喘颗粒主要通过METTL3增强miR-29a-3p的m^(6)A修饰水平,抑制气道上皮细胞泛凋亡,改善气道炎症。

circ_0114427靶向微小RNA-330-5p调控脂多糖诱导的肺泡上皮细胞凋亡及炎症反应

目的探讨circ_0114427对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症的影响及其机制。方法体外培养人肺泡上皮细胞,分别转染si-circ_0114427、微小RNA(miR)-330-5p mimics或共转染si-circ_0114427与anti-miR-330-5p后,用10 mg/L LPS处理24 h。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞中circ_0114427和miR-330-5p表达量;采用蛋白免疫印迹评估活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase3)和活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9(Cleaved-caspase9)蛋白水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达;采用流式细胞术分析细胞凋亡。采用双荧光素酶报告实验验证circ_0114427和miR-330-5p的互作关系。结果肺泡上皮细胞经LPS处理后,细胞中circ_0114427表达升高,miR-330-5p表达降低(P<0.05)。敲减circ_0114427或上调miR-330-5p可以抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9表达以及IL-6和TNF-α水平(P<0.05)。circ_0114427靶向结合并负调控miR-330-5p。miR-330-5p下调可以逆转circ_0114427敲低对LPS诱导的细胞凋亡和炎症的抑制作用。结论敲减circ_0114427可抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症,这可能与miR-330-5p上调有关。

细胞间黏附分子-1在支气管哮喘儿童支气管黏膜中的表达及其对支气管上皮细胞凋亡的影响

目的探讨细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在支气管哮喘儿童支气管黏膜中的表达及其对支气管上皮细胞凋亡的影响。方法收集驻马店市中心医院2014年5月至2017年12月收治的28例哮喘儿童的支气管黏膜组织标本,同时选取28例支气管扩张非哮喘儿童的支气管黏膜组织作为对照;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot法检测支气管哮喘儿童支气管黏膜组织中ICAM-1 mRNA和蛋白表达。将正常培养的支气管上皮细胞16HBE分为对照组、感染组、阴性组和干扰组。对照组细胞正常培养,不做任何处理;感染组细胞感染呼吸道合胞病毒(RSV),但不进行转染;阴性组细胞转染siRNA-control后感染RSV;干扰组细胞转染ICAM-1 siRNA后感染RSV。采用qRT-PCR和Western blot法检测各组细胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡情况,酶联免疫吸附试验检测细胞培养基上清液中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,Western blot法检测细胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、核因子-κB p65(NF-κB p65)表达。结果哮喘支气管黏膜组织中ICAM-1 mRNA和蛋白表达显著高于正常支气管黏膜组织(P <0. 05)。感染组、阴性组、干扰组细胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表达显著高于对照组(P <0. 05)。干扰组细胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表达显著低于感染组和阴性组(P <0. 05)。感染组、阴性组、干扰组细胞凋亡率显著高于对照组(P <0. 05)。干扰组细胞凋亡率显著低于感染组和阴性组(P <0. 05)。感染组、阴性组、干扰组细胞培养基上清液中IL-1β、TNF-α水平显著高于对照组(P <0. 05)。干扰组细胞培养基上清液中IL-1β、TNF-α水平显著低于感染组和阴性组(P <0. 05)。感染组、阴性组、干扰组细胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平显著高于对照组(P <0. 05)。干扰组细胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平显著低于感染组和阴性组(P <0. 05)。结论 ICAM-1在哮喘儿童支气管黏膜组织中表达上调,抑制ICAM-1可以降低RSV诱导的支气管上皮细胞凋亡,降低支气管上皮细胞中Cleaved Caspase-3、NF-κB p65蛋白表达,减少细胞分泌炎性因子。

LED光源照射及PI3K抑制剂对人视网膜色素上皮细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨LED光源照射对人视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬和凋亡的影响,以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002在光照下对RPE细胞自噬和凋亡的影响。方法体外培养人ARPE-19细胞,随机分为6 h对照组、6 h模型组、6 h LY294002组,12 h对照组、12 h模型组、12 h LY294002组,24 h对照组、24 h模型组、24 h LY294002组,分别给于设定时间的LED冷光照射或加入LY294002后的光照。采用噻唑蓝法检测各组细胞存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;透射电子显微镜观察各组细胞超微结构;构建稳定表达红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(LC3)的RPE细胞株,激光共聚焦合倒置荧光显微镜分析细胞自噬流变化;Western blot法检测苄氯素1(Beclin 1)、LC3和p62自噬相关蛋白表达水平。结果与对照组比较,6、12、24 h模型组细胞存活率均下降(均P<0.05),12、24 h LY294002组细胞存活率均下降(均P<0.01);与模型组比较,12、24 h LY294002组细胞存活率均升高(均P<0.05)。与对照组比较,6、12、24 h模型组和LY294002组细胞凋亡率均升高(均P<0.05);与模型组比较,6、12 h LY294002组细胞凋亡率均下降(均P<0.05)。模型组RPE细胞在光照24 h后,胞内可见较多的自噬泡,LY294002干预后也可见聚集性分布的自噬囊泡。观察自噬流发现,对照组少见红色亮点,模型组红色亮点荧光随光照时间延长数量逐渐增多,Merge图中黄色亮点数量增多明显,LY294002干预后,红色亮点与黄色亮点呈增多趋势。与对照组比较,6、12、24 h模型组和LY294002组细胞中Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平均升高,p62蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组比较,6、12、24 h LY294002组细胞中Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达均升高,12、24 h LY294002组细胞中p62蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论LED光源照射可刺激ARPE-19细胞发生自噬,增加细胞凋亡率;PI3K抑制剂LY294002能上调细胞的自噬活性,减缓凋亡。

干扰SOCS1基因表达对猪乳腺上皮细胞凋亡的调控效应

细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)是一种调节细胞内信号通路活性的负调控因子,参与调控机体细胞的多种生理功能。为探索SOCS1基因沉默对猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响,试验通过构建猪SOCS1基因shRNA干扰载体,转染猪乳腺上皮细胞,TMT定量蛋白组学筛选差异蛋白,Annexin V/PI、CCK-8和流式细胞术检测细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡。结果显示,干扰组(shRNA-SOCS1-138)与空白组相比,共筛选到差异表达蛋白52个,其中上调蛋白26个,下调蛋白26个。GO富集发现,差异蛋白主要富集在病毒防御响应、EB病毒遗传缺陷反应后的免疫缺陷和对其他生物的免疫反应几个方面。KEGG通路富集发现,差异蛋白主要富集在坏死性凋亡、丙型肝炎和全身性红斑狼疮信号通路。干扰SOCS1后,乳腺上皮细胞450 nm的OD值在12、24、48 h和72 h的细胞量显著或极显著高于空白组;G1期和G2期细胞占比均极显著高于空白组,S期细胞百分比极显著低于空白组;干扰组与空白组之间细胞凋亡率差异达到显著水平。综合研究结果揭示,SOCS1基因沉默可促进细胞增殖和降低细胞的凋亡,引起G1/S期阻滞,并受多个信号通路的调控作用。

山茱萸总苷抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞系HK-2凋亡和氧化损伤

目的探究山茱萸总苷(COG)调节E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)通路对高糖诱导的人肾小管上皮细胞系HK-2的凋亡和氧化损伤的影响。方法将人肾小管上皮细胞系HK-2分为对照组(control,5.5 mmol/L)、模型组(HG,30 mmol/L)、山茱萸总苷低、中和高剂量组(L-COG、M-COG、H-COG),加入Nrf2通路抑制剂后,HK-2细胞分为H-COG组、ML385组。CCK8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、活化的胱天蛋白酶(cleaved-caspase3)、Nrf2/HO-1通路蛋白表达,DCFH-DA法检测活性氧(ROS)含量,ELISA法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、白介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果与对照组比较,模型组细胞活性、Bcl-2蛋白表达、GSH-Px及SOD活性明显降低,凋亡率、Bax、Nrf2、HO-1及cleaved-caspase3蛋白表达、ROS、IL-6、TNF-α含量明显增加(P<0.05);与模型组比较,L-COG、M-COG、H-COG组细胞活性、Bcl-2蛋白表达、GSH-Px、SOD活性明显增加,凋亡率、Bax、Nrf2、HO-1及cleaved-caspase3蛋白表达、ROS、IL-6、TNF-α含量明显降低(P<0.05)。与H-COG组比较,ML385组细胞活性、Bcl-2蛋白表达、GSH-Px活性、SOD活性明显增加,凋亡率、Bax及cleaved-caspase3蛋白表达、ROS、IL-6、TNF-α含量明显降低(P<0.05)。结论山茱萸总苷可能是通过抑制Nrf2/HO-1通路减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞氧化应激和炎性反应,进而减轻细胞凋亡。

过表达miRNA-424-5p靶向AKT3对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡的影响

[目的]本试验通过过表达miRNA-424-5p,明确miRNA-424-5p与其靶基因丝氨酸/苏氨酸激酶3(AKT serine/threonine kinase 3,AKT3)对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡影响的机制,为阐明miRNA-424-5p在奶牛胎盘分离过程中的作用机制提供试验基础和理论依据。[方法]试验分为3组:空白对照组(Control)、阴性对照组(miRNA-424-5p mimics NC)和过表达组(miRNA-424-5p mimics)。采用茎环法实时荧光定量PCR检测转染miRNA-424-5p mimics后奶牛子宫内膜上皮细胞miRNA-424-5p的表达变化;采用Western blotting及实时荧光定量PCR检测过表达后AKT3和凋亡相关因子的表达变化,采用Annexin V-FITC/PI法检测奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡情况。[结果]与空白对照及阴性对照组相比,转染miRNA-424-5p mimics后子宫内膜上皮细胞miRNA-424-5p mRNA的表达量极显著升高(P<0.01),B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase3)和Caspase9的mRNA表达量极显著升高(P<0.01),AKT3和Bcl-2的mRNA表达量极显著降低(P<0.01);Bax和Caspase3蛋白表达量极显著升高(P<0.01),Caspase9蛋白表达量显著升高(P<0.05),AKT3和Bcl-2蛋白表达量极显著降低(P<0.01);细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)。[结论]过表达miRNA-424-5p可通过靶向调控AKT3使奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡因子Bax、Caspase3和Caspase9的表达量增加,使Bcl-2的表达量降低,进而促进细胞凋亡。

瑞马唑仑调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对烧伤大鼠肠上皮细胞凋亡的影响

目的探究瑞马唑仑(Rem)调节Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子88(MyD88)/核因子-κB(NF-κB)信号通路对烧伤大鼠肠上皮细胞凋亡的影响。方法将造模成功的烧伤大鼠随机分为模型组(Model组),药物低、中、高剂量处理组(Rem-L组、Rem-M组、Rem-H组)和高剂量瑞马唑仑+TLR4激活剂组(Rem-H+LPS组),另取健康的大鼠作对照组(Control组)。在对大鼠尾静脉采血且行安乐死后取其肠组织样本。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清炎性因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平;HE染色观察肠组织形态;TUNEL检测试剂盒检测细胞凋亡;免疫组化检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达;免疫印迹实验检测凋亡蛋白Bax及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达。结果与Control组相比,Model组细胞排列紊乱,有炎症表现,IL-1β、IL-6水平、细胞凋亡率升高,Bax、TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB表达上调,ZO-1、Occludin表达下调(P<0.05);与Model组比较,Rem-L、Rem-M、Rem-H组肠黏膜炎症浸润逐渐减轻,IL-1β、IL-6水平、细胞凋亡率降低,Bax、TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB表达下调,ZO-1、Occludin表达上调,呈剂量依赖性(P<0.05);与Rem-H组相比,Rem-H+LPS组组织炎症加重,IL-1β、IL-6水平、细胞凋亡率升高,Bax、TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB表达上调,ZO-1、Occludin表达下调(P<0.05)。结论Rem可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路缓解烧伤大鼠肠上皮细胞的损伤,从而保护肠黏膜。

蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡及炎症因子分泌的调节作用

目的分析蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡及炎症因子分泌的调节作用。方法将肺泡上皮细胞A549分为感染组(1×108/CFU/mL的肺炎链球菌培养细胞)、对照组(不作处理)、感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组(10、20、40μmol/L蟛蜞菊内酯预处理,之后采用1×108/CFU/mL的肺炎链球菌培养细胞)。检测细胞凋亡率、凋亡相关蛋白表达量、炎症因子mRNA相对表达量及水平。结果与对照组相比,感染组、感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达量、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA相对表达量及水平较高,Bcl-2蛋白表达量较低(P<0.05);与感染组相比,感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达量、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA相对表达量及水平较低,Bcl-2蛋白表达量较低,且感染+蟛蜞菊内酯高剂量组凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达量、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA相对表达量及水平最高,Bcl-2蛋白表达量最低(P<0.05)。结论肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞经蟛蜞菊内酯干预后细胞凋亡率下降,炎症因子分泌减少。

谷氨酰胺二肽对奶牛小肠上皮细胞增殖与凋亡的影响

【目的】旨在研究2种谷氨酰胺二肽对奶牛小肠上皮细胞增殖及凋亡的影响。【方法】对体外培养的奶牛小肠上皮细胞进行谷氨酰胺(Glutamine,Gln)饥饿处理后,分别添加Gln、丙氨酰谷氨酰胺(Alanyl-glutamine,Ala-Gln)和甘氨酰谷氨酰胺(Glycyl-glutamine,Gly-Gln)进行处理,检测各处理组细胞的细胞活力、细胞凋亡率及周期、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)漏出量及凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2和Caspase-3)的表达量。【结果】与CK(Gln饥饿处理组)相比,添加Ala-Gln或Gly-Gln的奶牛小肠上皮细胞的细胞活力显著提高(P<0.05),LDH漏出量显著降低(P<0.05)。此外,与CK相比,添加Gln、Ala-Gln及Gly-Gln均能显著降低G0/G1和G2/M期阻滞细胞比率,提高S期细胞比率(P<0.05),也能显著提高抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达,而显著降低促凋亡因子Bax和Caspase-3蛋白表达(P<0.05),从而显著降低细胞凋亡率(P<0.05)。【结论】谷氨酰胺二肽(Ala-Gln及Gly-Gln)能够促进奶牛小肠上皮细胞增殖并减缓其凋亡,从而保护肠道黏膜结构的完整性。该研究结果可为谷氨酰胺二肽在奶牛肠道营养中的应用提供理论依据。

葛根素对火药烟雾诱导支气管上皮细胞凋亡的防护作用

目的探讨葛根素对火药烟雾诱导的支气管上皮细胞(BEAS-2B)凋亡的保护作用及其机制。方法体外培养BEAS-2B细胞,随机分为对照组(不加任何干预)、烟熏组(火药烟雾4g,作用10min)、烟熏+葛根素组(12.5、25、50、100μg/ml)。细胞接种12h后加入葛根素,继续培养至24h后烟雾作用10min,继续培养2h后进行检测。采用CCK-8试剂盒检测细胞活力,Hoechst染色观察细胞凋亡情况,流式细胞仪检测Annexin V-PI双染细胞及caspase-3阳性率。结果与对照组相比,烟熏组BEAS-2B细胞活力明显下降(P<0.01),不同浓度葛根素能够不同程度地对抗烟熏的作用,其最佳保护浓度为25μg/ml。与烟熏组相比,烟熏+葛根素组Hoechst染色细胞凋亡率、Annexin V-PI双染细胞凋亡率及caspase-3阳性率均明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论火药烟雾可致体外BEAS-2B细胞凋亡,而葛根素对火药烟雾诱导的BEAS-2B气管上皮细胞凋亡具有一定防护作用。

角质细胞生长因子对口腔黏膜上皮细胞凋亡的作用研究

目的研究不同浓度角质细胞生长因子(KGF)对口腔黏膜上皮细胞凋亡的作用,为探讨KGF在口腔黏膜病发生发展中的作用提供依据。方法将不同浓度的KGF(对照组0 ng·mL-1,实验1组5 ng·mL-1,实验2组25 ng·mL-1,实验3组50 ng·mL-1)分别加入体外培养的口腔黏膜上皮细胞,培养12、24、48 h后,倒置显微镜下观察其对细胞形态的影响,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,荧光实时定量检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达水平。结果 1)实验组较对照组细胞贴壁明显,且48 h时实验3组细胞核仁明显。2)培养48 h时,4组之间的细胞凋亡率、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达均有统计学差异,随着KGF浓度的增加,细胞凋亡率和Bax mRNA表达逐渐降低,Bcl-2 mRNA表达逐渐升高(P<0.05)。结论 KGF可通过上调Bcl-2 mRNA和下调Bax mRNA的表达抑制上皮细胞的凋亡。