三子养亲汤调控TGF-β1/Smad2/3信号通路抑制哮喘模型小鼠气道上皮间质转化的作用机制研究

目的:探讨三子养亲汤对哮喘模型小鼠气道上皮间质转化(EMT)的影响及其可能的分子机制。方法:将40只Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组(每日0.75 mg/kg)和三子养亲汤低、高剂量组(每日5.4、10.8 g/kg),每组8只。除正常组外其余各组小鼠采用鸡卵白蛋白(OVA)腹腔注射及滴鼻激发方式制作哮喘模型,于造模开始后第14天始,各给药组分别灌胃给予相应药物,正常组及模型组灌胃等量无菌水,各组均连续灌胃14 d。末次激发24 h后,每组随机选6只小鼠依次放入全体容积描计箱内,以不同浓度的氯化乙酰甲基胆碱(Mch)雾化1 min后,测定激发5 min内小鼠支气管收缩参数增强呼吸间歇(Penh)。随后各组小鼠予10%水合氯醛腹腔注射麻醉,摘眼球取血,分离血清,-80℃保存备测,取每组6只小鼠血清运用酶联免疫吸附法测定免疫球蛋白E(Ig E)水平。处死小鼠,取每组3只小鼠左上肺叶组织,苏木精伊红(HE)染色后观察小鼠肺组织病理。取每组6只小鼠右上肺组织,蛋白质免疫印迹(Westernblot)法检测肺组织TGF-β1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)相对表达量及磷酸化细胞信号转导分子2/3(P-Smad2/3)蛋白相对表达量。结果:经Mch激发后,模型组小鼠Penh值明显高于正常组(P<0.01);各给药组Penh值不同程度低于模型组,其中以地塞米松组(Mch各激发剂量)和三子养亲汤高剂量组(Mch=25.000 g/L)降低最为明显(P<0.01)。模型组小鼠血清IgE水平明显高于正常组(P<0.01),三子养亲汤低剂量组、地塞米松组小鼠血清IgE水平明显低于模型组(P<0.05)。与正常组比较,模型组小鼠肺组织炎症水平增加,气道平滑肌增厚,气道上皮细胞排列紊乱伴部分上皮细胞脱落;各给药组小鼠上述病理改变均明显改善,以三子养亲汤高剂量组及地塞米松组改善更为显著。模型组小鼠肺组织N-cadherin、α-SMA蛋白表达水平显著高于正常组(P<0.01),E-cadherin蛋白表达水平显著低于正常组(P<0.01);三子养亲汤高剂量组、地塞米松组小鼠肺组织E-cadherin蛋白相对表达量明显高于模型组(P<0.01),三子养亲汤各剂量组小鼠肺组织N-cadherin蛋白相对表达量明显低于模型组(P<0.01),各给药组小鼠肺组织α-SMA相对表达量均明显低于模型组(P<0.05,P<0.01)。模型组小鼠肺组织TGF-β1,P-Smad2/Smad2及P-Smad3/Smad3水平均显著高于正常组(P<0.01,P<0.05);三子养亲汤各剂量组小鼠肺组织上述蛋白相对表达量均显著低于模型组(P<0.05,P<0.01);三子养亲汤低剂量组TGF-β1水平及三子养亲汤各剂量组P-Smad2/Smad2水平均明显低于地塞米松组(P<0.05,P<0.01)。结论:三子养亲汤可能通过降低TGF-β1表达,抑制Smad2/3信号通路激活,从而减少哮喘气道EMT改变,达到治疗哮喘的目的。

芪仙汤提取物抑制哮喘气道上皮间质转化的研究

目的以16 HBE人支气管上皮细胞株为研究对象,通过体外研究探讨芪仙汤提取物对哮喘气道上皮间质转化的影响。方法将16HBE细胞加入不同浓度的H_2O_2及芪仙汤提取物干预不同时间。观察细胞形态改变; CCK-8检测H_2O_2对16HBE细胞活力的影响; RT-PCR检测E-cadherin、α-SMA基因表达水平; Western blot检测E-cadherin、α-SMA蛋白表达水平;免疫荧光检测E-cadherin,α-SMA蛋白表达水平及蛋白定位。结果 H_2O_2作用后细胞形态呈EMT改变,而芪仙汤提取物可逆转细胞EMT改变;CCK-8结果显示,H_2O_2作用后气道上皮细胞存活率随浓度增加而降低(P<0.01),芪仙汤提取物可以减少H_2O_2诱导的气道上皮细胞损伤(P<0.01)。RT-PCR检测结果示,H_2O_2刺激后气道上皮细胞E-cadherin mRNA水平显著降低(P<0.01),α-SMA mRNA水平增高(P<0.05),芪仙汤提取物作用后可以逆转H_2O_2诱导的E-cadherin转录水平降低(P<0.05),抑制H_2O_2诱导的α-SMA mRNA表达水平增加(P<0.05)。Western blot及免疫荧光检测结果示E-cadherin、α-SMA蛋白表达水平与基因表达水平相一致(P<0.05)。结论芪仙汤提取物可以减少氧化应激诱导的气道上皮细胞损伤及气道上皮间质转化。

健脾防哮方抑制哮喘小鼠气道上皮间质转化的研究

目的探讨健脾防哮方对卵蛋白诱导的哮喘小鼠气道上皮间质转化的影响。方法将60只雄性Balb/c小鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、健脾防哮方低剂量组、健脾防哮方中剂量组、健脾防哮方高剂量组和地塞米松组,每组10只。适应饲养后,除正常组外,其余组均于第1,7,14天腹腔注射0.1 mL致敏液(生理盐水0.1 mL+卵蛋白0.05 mg+氢氧化铝1 mg),第21天开始予1%的卵蛋白雾化液(卵蛋白0.1 g+生理盐水10 mL)加压雾化激发4周建立哮喘模型。雾化激发前,正常组及模型组开始给予25 mL/(kg·d)蒸馏水灌胃,健脾防哮方低、中、高剂量组分别给予5.233 g/(kg·d)、10.465 g/(kg·d)、20.93 g/(kg·d)健脾防哮方灌胃,地塞米松组给予地塞米松0.5 mg/(kg·d)灌胃,均持续4周。实验结束后,苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理形态学变化,Masson染色观察肺组织胶原沉积与纤维增生情况,免疫组化和Western blot法检测各组小鼠肺组织中E-钙黏素(E-cadherin)、N-钙黏素(N-cadherin)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达情况,Real-time PCR法检测各组小鼠肺组织中E-cadherin、N-cadherin、α-SMA mRNA表达情况。结果与正常组比较,模型组小鼠支气管上皮细胞不完整,存在坏死且炎性细胞浸润明显,气道周围存在明显胶原纤维沉积;与模型组比较,各药物组小鼠病理改变均有不同程度减轻,胶原蛋白沉积明显减少,其中健脾防哮方高、中剂量组和地塞米松组改善更明显。与正常组比较,模型组小鼠肺组织中N-cadherin和α-SMA蛋白及mRNA表达量均明显增加(P均<0.05),E-cadherin蛋白及mRNA表达量均明显降低(P均<0.05);与模型组比较,各药物组小鼠肺组织中N-cadherin和α-SMA蛋白及mRNA表达量均明显降低(P均<0.05),健脾防哮方高、中剂量组和地塞米松组E-cadherin蛋白及mRNA表达量均明显增高(P均<0.05),且健脾防哮方高、中剂量组各指标表达变化较健脾防哮方低剂量组更明显(P均<0.05)。结论健脾防哮方可以减轻卵蛋白诱导的哮喘气道上皮损伤,抑制气道上皮间质转化。

BMS-345541对哮喘小鼠气道重塑和气道上皮间质转化的抑制作用

目的探讨BMS-345541对哮喘小鼠气道重塑和气道上皮间质转化的抑制作用。方法48只C57BL/6J小鼠随机分为对照组(n=16,不做任何处置)、哮喘模型组(n=16)、BMS组(n=16,哮喘模型同时腹腔注射BMS-345541)。用卵清蛋白(OVA)建立小鼠哮喘模型。BMS-345541/二甲基亚砜(DMSO)在建立哮喘模型后给予小鼠每日灌胃。灌胃24h分别收集小鼠血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺样品并对肺组织进行染色,评估其病理变化。ELISA法测定血清和BALF中的TGF-β1浓度;实时荧光定量PCR法测定E-钙黏蛋白和波形蛋白mRNA的转录水平;免疫组化染色检测EMT调节剂E-钙黏蛋白和波形蛋白的表达。结果OVA成功诱发过敏性哮喘。与对照组相比,模型组小鼠气道壁增厚(P<0.05),BALF中细胞总数增加,TGF-β1和EMT高度表达(P<0.05)。与模型组比较,BMS组肺嗜酸性粒细胞渗透性增强,黏液分泌过多,TGF-β1水平降低,波形蛋白下调,E-钙黏蛋白表达增加(P<0.05)。结论OVA哮喘小鼠存在EMT气道重塑;BMS-345541可能会改变哮喘小鼠气道重塑和气道上皮间质转化,减轻气道重塑,抑制EMT。

平喘方通过上调哮喘小鼠肺泡灌洗液中miR-23b的表达改善气道重塑的研究

研究平喘方通过上调外泌体miR-23b干预TGF-β/EMT,改善OVA诱导的哮喘小鼠气道重塑的内在机制。将40只BALB/c雄性小鼠,按照随机数字表分为空白组、哮喘模型组、平喘方组、地塞米松组,每组10只。第1 d、14 d模型组、平喘方组、地塞米松组腹腔注射10%OVA+铝镁佐剂致敏,第21~49 d隔日运用2.5%OVA雾化激发,并每日灌胃给药,连续给药28 d,末次给药24 h后取材。苏木素-伊红(HE)染色及马松(Masson)染色观察各组小鼠肺组织病理学变化,透射电镜下观察肺泡灌洗液(BALF)中的外泌体形态,免疫印迹法(Western blot)检测外泌体表面标记蛋白CD9、CD63、CD81含量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-Time PCR)检测BALF外泌体中miR-23b mRNA水平,免疫印迹法(Western blot)检测转化生长因子β1(TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白1(ZO-1)蛋白含量。各组小鼠BALF中提取外泌体均表达CD9、CD63、CD81蛋白,证明本研究成功提取外泌体。与空白组比较,病理染色见模型组小鼠支气管周围炎性细胞浸润,气道管壁肌层增厚,胶原纤维增多,外泌体中miR-23b mRNA水平显著降低,肺组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、TGF-β1、α-SMA、Vimentin蛋白水平显著升高(P<0.01),E-cadherin、ZO-1蛋白水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,平喘方组与地塞米松组病理损伤较轻,未见明显炎性细胞浸润,气道胶原纤维减少,外泌体中miR-23b mRNA水平显著升高(P<0.01),Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、TGF-β1、α-SMA、Vimentin蛋白水平明显下调(P<0.01,P<0.05),E-cadherin、ZO-1蛋白水平显著升高(P<0.01,P<0.05)。平喘方可以改善哮喘小鼠气道重塑,其机制可能与上调外泌体miR-23b表达,进而抑制TGF-β/EMT信号轴,缓解气道重塑有关。

喘可治注射液对人胚胎肺成纤维细胞转化因子及相关蛋白的影响

目的:通过喘可治注射液(CKZ)干预人胚胎肺成纤维细胞(Wi-38),测定β转化生长因子(TGF-β)、1型胶原纤维蛋白(collagen1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),探讨CKZ在抑制细胞间质转化方面的作用机制。方法:将体外培养的Wi-38细胞随机分为6组:① 对照组,单独的DMEM培养;② 5 ng/mL TGF-β组,加入浓度为5 ng/mL的TGF-β孵育;③ 10 ng/mL TGF-β组,加入浓度为10 ng/mL的TGF-β孵育;④10 ul/mL喘可治注射液(CKZ)组,加入浓度为10 ul/mL CKZ的孵育;⑤ 20 ul/mL CKZ组,加入浓度为20 ul/mL CKZ的孵育;⑥ 10 ng/mL TGF-β + 20 ul/mL CKZ组,同时加入浓度10 ng/mL TGF-β和20 ul/mL CKZ孵育。采用实时荧光定量(qPCR)的方法检测孵育24 h、48 h、72 h的TGF-β、collagen 1、α-SMA的表达水平变化。结果:加入TGF-β处理组细胞的α-SMA、Collagen 1的mRNA水平升高、TGF-β的mRNA水平降低,与对照组相比,其差异均具有统计学意义(P 【0.05);加入CKZ处理组细胞的α-SMA、TGF-β、Collagen 1的mRNA水平均降低,与对照组相比,其差异具有统计学意义(P 【0.05);同时加入TGF-β和CKZ处理组细胞的α-SMA、Collagen 1的mRNA水平均显著降低,与TGF-β处理组相比,其差异具有统计学意义(P 【0.05)。结论:TGF-β、collagen 1、α-SMA参与了人胚胎肺成纤维细胞间质转化的病理进程,CKZ对这一进程起到了抑制作用,CKZ具有一定的抑制气道上皮间质转化的作用。