原代人气道基底细胞的分离与培养

目的:构建成熟的原代人气道基底细胞的分离、培养与传代体系。方法:从废弃的供肺或切除的病肺中分离出气管或较大的支气管;采用蛋白酶、DNA酶消化,搔刮气管或支气管内膜分离基底细胞,接种于Purecol包被的培养瓶,Epi XBase培养基培养、传代;免疫荧光染色法鉴定TRP63+KRT5+基底细胞;比较健康捐赠者和病肺来源的原代气道基底细胞活性。结果:成功分离培养38株人原代人气道基底细胞。标本来源宿主中男性21名、女性17名,年龄中位数59岁(2,77)。其中健康捐献者12例,慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者11例,特发性肺纤维化(IPF)患者9例,系统性硬化肺纤维化3例,朗罕氏细胞增生症1例,尘肺病1例,特发性肺高压1例。人气道基底细胞镜下呈多边形,成片连接,形似蜂巢,细胞间连接紧密。成熟细胞形态较均一,细胞核大,胞浆内可见颗粒。免疫荧光染色证实为TRP63+KRT5+基底细胞。38株人气道基底细胞第1代细胞活性为81.25%±0.12%。健康捐献者来源(12例)与病肺来源(26例)的细胞株活性无明显统计学差异。结论:本研究中,分离和培养人气道基底细胞成功率高,细胞纯度高,细胞活性也较高,为人气道基底细胞体外试验提供了技术基础。健康捐献者来源与病肺来源的第1代细胞活性无明显统计学差异。

小鼠原代气道上皮基底细胞分离、增殖与气液界面培养诱导的定向分化

目的探究小鼠原代气道上皮基底细胞分离、增殖和气液界面(ALI)培养诱导定向分化的方法。方法无菌获取小鼠气管,改良酶消化法分离基底细胞,免疫荧光鉴定。细胞传代,倒置显微镜观察细胞增殖生长,免疫荧光检测KRT5表达水平。气液界面(ALI)培养,HE染色、扫描电镜观察定向分化情况。结果改良酶消化法及增殖培养基培养,可分离基底细胞,免疫荧光检测KRT5阳性。基底细胞增殖效果好,已传至第八代(P8),但P5以后,细胞老化增多,免疫荧光强度变弱。ALI培养诱导的定向分化,HE染色观察P1~P3细胞层多、且高,P1~P4游离面可见纤毛;扫描电镜观察P1~P4细胞游离面特化结构数量多,P5~P8细胞游离面特化结构少。结论该方法可分离纯度、活性均高的基底细胞,并可传代增殖培养,P4之前基底细胞增殖和定向分化效果好,为进一步研究体外气道重塑相关实验提供了细胞支撑。