气道抽吸液标本单细胞转录组测序前细胞处理技术的比较

目的探索适用于气道抽吸液标本单细胞转录组测序的细胞前处理方法。方法从4例急性呼吸道感染患者中新鲜采集4份气道抽吸液标本, 用痰消化液消化后过细胞滤网制备成单细胞悬液, 分别用新鲜细胞直接建库(direct emulsion, DE)、用10×Genomics的单细胞RNA固定试剂固定后混合建库(direct-fix, DF)、将细胞冻存复苏再固定后(frozen-fix, FF)混合建库3种方法操作, 3种方法均以104个细胞进行油包水处理, 用10×Genomics平台进行单细胞测序, 对获取的细胞数量、数据质量、注释的细胞种类、标记基因的表达水平进行比较分析, 用Pearson相关性分析3种前处理方法获得的同种细胞亚群高变基因表达差异。比较3种前处理方法获得的同一细胞亚群的差异基因在不同方法之间的表达水平。通过Pearson相关分析研究3种前处理方法获得的同一细胞亚群之间差异基因表达的相关性。结果 DE、FF、DF方法获得的单细胞数量中位数分别为2 733、1 140和5 897个(P>0.05), 唯一分子识别符高于500, 基因中位数分别为801、887、1 259(P>0.05)。评估RNA复杂度的新颖性评分超过0.8的细胞比例分别为99%、87%和93%。3种方法获得的细胞亚群均有鳞状上皮细胞、分泌细胞、纤毛细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞、中性粒细胞等9种细胞亚群, 与DE方法比较, DF和FF方法可多获得特异性高表达角蛋白5的基底细胞。3种前处理方法中同一细胞亚群差异基因和高变基因在不同方法之间表达高度一致, 具有显著相关性(P<0.001)。结论在相同的测序数据量下, 气道抽吸液标本单细胞悬液先固定再进行探针杂交和转录组测序的方法得到的数据质量与新鲜细胞直接操作的质量相近, 该方法更适用于临床样本的单细胞转录组测序分析的样本前处理过程。