miR-126-5p通过靶向TRAF3抑制糖氧剥夺再灌注介导的HT22细胞凋亡和炎症

目的探讨miR-126-5p通过靶向肿瘤坏死因子受体相关因子3(tumor necrosis factor receptor-associated factor 3,TRAF3)对糖氧剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)介导的小鼠海马神经元细胞HT22细胞凋亡和炎症的影响。方法模拟缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)损伤在体外建立氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)细胞模型,分析miR-126-5p与TRAF3靶向关系及对HT22细胞凋亡和炎症反应的影响。结果与对照组比较,OGD/R组中miR-126-5p下调而TRAF3 mRNA及蛋白水平上调,细胞存活率及Bcl-2蛋白水平降低,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量、细胞凋亡率、Bax及Cleaved caspase-3蛋白水平升高(P均<0.05)。与OGD/R+mimic-NC组比较,OGD/R+miR-mimic组、OGD+miR-mimic+pcDNA组TRAF3蛋白水平、LDH释放量、细胞凋亡率、Bax及Cleaved caspase-3蛋白水平明显降低,细胞存活率及Bcl-2蛋白水平升高,而OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3组各指标升高,细胞存活率明显下降(P均<0.05)。结论miR-126-5p通过靶向TRAF3,抑制OGD/R介导的HT22细胞凋亡和炎症反应,从而对神经元细胞发挥保护作用。

羟基红花黄色素A抑制糖氧剥夺/复糖复氧处理后神经元焦亡的作用

背景:羟基红花黄色素A具有抗缺血、抗氧化、抗血栓及抗炎等作用,其是否影响糖氧剥夺/复糖复氧处理后神经元焦亡,目前尚不清楚。目的:探讨羟基红花黄色素A对神经元焦亡的干预作用及机制。方法:取对数生长期的HT22细胞,随机分为5组:正常组、模型组、羟基红花黄色素A组、Colivelin组、Colivelin+羟基红花黄色素A组。利用糖氧剥夺/复糖复氧处理HT22细胞建立神经元焦亡模型,然后给予STAT3激动剂Colivelin、羟基红花黄色素A干预。干预后JC-1探针检测线粒体膜电位变化,活性氧试剂盒检测细胞内活性氧含量,GSDMD/TUNEL染色观察细胞焦亡情况,免疫荧光检测STAT3、GSDMD蛋白表达,RT-PCR检测STAT3、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达,Western blot检测p-STAT3、NLRP3、GSDMD、Cleaved-caspase-1、白细胞介素1β蛋白表达。结果与结论:①与正常组相比,模型组焦亡细胞数量增多,p-STAT3、NLRP3、Cleaved-caspase-1、GSDMD、白细胞介素1β蛋白表达显著升高;与模型组相比,羟基红花黄色素A组焦亡细胞数量减少,焦亡相关蛋白的表达显著降低;②与模型组相比,Colivelin组细胞焦亡加剧,线粒体膜电位降低,活性氧含量增加,STAT3、NLRP3、Caspase-1 mRNA表达升高,p-STAT3、NLRP3、GSDMD、Cleaved-caspase-1、白细胞介素1β蛋白表达升高;与Colivelin组相比,Colivelin+羟基红花黄色素A组上述指标均有好转。结果表明:羟基红花黄色素A通过STAT3信号通路抑制糖氧剥夺/复糖复氧后HT22细胞焦亡发挥神经保护作用。

基于PARP1信号通路研究芒柄花素对糖氧剥夺/复氧复糖神经元细胞损伤的影响

目的 基于PARP1信号通路研究芒柄花素对糖氧剥夺/复氧复糖神经元细胞损伤的影响,为揭示运用锦鸡儿异黄酮治疗脑缺血再灌注损伤提供理论依据。方法 建立小鼠神经元细胞(HT22)糖氧剥夺/复氧复糖(OGD/R)模型,通过Western blot检测糖氧剥夺/复氧复糖不同时间HT22神经元细胞中PARP1和PARG表达情况,选择通路变化最佳时间点。分别使用芒柄花素、PARP1抑制剂(PJ34)和PARG抑制剂处理OGD/R后的HT22细胞,设置6个组,分别为对照组、对照组+芒柄花素组、OGD/R组、OGD/R+芒柄花素组、OGD/R+PJ34组、OGD/R+PARG抑制剂组。对照组HT22细胞正常培养,不进行OGD/R处理;采用免疫荧光、Western blot法检测各组细胞凋亡因子、相关蛋白表达水平。结果 在糖氧剥夺/复氧复糖3 h后,HT22细胞中PARP1通路激活最明显,在OGD/R 3 h条件下,芒柄花素、PJ34或PARG抑制剂处理后可提高E3泛素连接酶(Iduna),抑制PARP1、PARG通路蛋白表达,并降低AIF和P53表达,提高AKT蛋白磷酸化水平。结论 HT22小鼠神经元细胞在OGD/R条件下,芒柄花素可通过提高Iduna蛋白表达抑制PARP1/AIF/Akt信号通路减轻HT22小鼠神经元细胞损伤。

黄芪甲苷与丹参酮ⅡA配伍拮抗内皮细胞糖氧剥夺损伤促进血管新生

目的观察益气活血药对黄芪、丹参的有效活性成分黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-Ⅳ)与丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA,TanⅡA)配伍拮抗内皮细胞糖氧剥夺(Oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤的效应,探索其促进血管新生的作用及机制。方法通过体外培养内皮细胞建立OGD损伤模型,实验设置对照组、模型组、AS-Ⅳ组、TanⅡA组和配伍组。分别采用CCK-8法、Transwell、体外血管形成实验观察AS-Ⅳ与TanⅡA配伍对内皮细胞增殖、迁移、成管能力的影响;利用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测内皮细胞的凋亡情况;免疫印迹法检测VE-cadherin、TGF-β1、VEGFA、eNOS的蛋白表达;免疫荧光法检测CD31、eNOS的蛋白表达;同时采用酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中一氧化氮(Nitric oxide,NO)的浓度。结果与正常对照组相比,糖氧剥夺使HUVECs增殖、迁移与成管功能受损,诱导细胞凋亡,降低VEcadherin、TGF-β1、VEGFA、CD31、eNOS的蛋白表达以及NO含量(P<0.01)。药物配伍组与模型组相比能修复损伤的内皮细胞,促进其增殖、迁移和成管,抑制糖氧剥夺诱导的细胞凋亡,提高VE-cadherin、TGF-β1、VEGFA、CD31、eNOS的蛋白表达以及NO含量(P<0.05)。结论AS-Ⅳ与TanⅡA配伍具有拮抗内皮细胞糖氧剥夺损伤、激活血管新生反应的作用,其机制可能是激活eNOS,促进内皮细胞NO的生成与释放。

PEG化甲氧基雌二醇纳米粒减轻糖氧剥夺/再灌注后脑血管内皮屏障损伤

目的探究PEG化甲氧基雌二醇(polyethylene glycol-2-methoxyestradiol,PEG-2ME_(2)/2ME_(2))纳米粒对糖氧剥夺/再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)后脑血管内皮细胞RBE4的影响。方法通过溶剂挥发法构建PEG-2ME_(2)/2ME_(2)纳米粒,通过透射电镜(transmission electron microscope,TEM)和激光粒度分析仪检测纳米粒表征;通过CCK-8法检测PEG-2ME_(2)/2ME_(2)纳米粒对RBE4的细胞毒性;使用OGD/R体外模拟缺血再灌注,通过CCK-8法检测细胞活性,采用Western blot法和免疫荧光法对紧密连接蛋白的表达情况进行检测,以及通过建立体外血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)模型和检测荧光探针渗漏情况综合评估脑血管内皮细胞的屏障功能;利用活性氧(reactive oxygen species,ROS)探针检测RBE4细胞内ROS水平;采用Western blot法检测过氧化物歧化酶判断RBE4细胞内氧化还原情况。结果透射电镜结果显示,PEG-2ME_(2)/2ME_(2)纳米粒球形形态稳定;激光粒度分析仪结果显示,PEG-2ME_(2)/2ME_(2)纳米粒大小均一;CCK-8法检测结果显示,PEG-2ME_(2)/2ME_(2)纳米粒中2ME_(2)浓度小于5μmol/L对RBE4细胞无明显的细胞毒性;CCK-8法检测结果显示,PEG-2ME_(2)/2ME_(2)纳米粒较2ME_(2)单药能显著挽救OGD/R后RBE4细胞的细胞活性,能遏止紧密连接蛋白表达下调,能有效恢复脑血管内皮细胞的屏障功能;ROS探针检测和Western blot法检测结果显示,PEG-2ME_(2)/2ME_(2)纳米粒较2ME_(2)单药能明显降低细胞内ROS水平,恢复超氧化物歧化酶的表达。结论PEG-2ME_(2)/2ME_(2)纳米粒大小、形态均一稳定,对RBE4细胞起到保护作用,有效恢复血脑屏障的完整性和屏障功能,有望成为OGD/R后脑血管内皮屏障损伤治疗的潜在药物。

Cu-ATSM保护内皮细胞糖氧剥夺再灌注损伤的机制

目的:探讨铜-二乙酰-2(N4-甲基氨基硫脲)(Cu-ATSM)对糖氧剥夺再灌注(OGD/R)后人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的作用及其潜在机制。方法:将体外培养的HUVECs分为Control组、OGD/R组、OGD/R+Cu-ATSM组;采用流式细胞术检测HUVECs的凋亡情况;采用Mito-tracker染色检测线粒体形态;JC-1染色分析各组线粒体膜电位的变化;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测各组自噬相关蛋白如ATG5、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ的激活情况;采用免疫荧光检测各组细胞LC3Ⅱ的表达情况。结果:流式细胞术结果显示,与Control组比,OGD/R损伤后HUVECs凋亡数目显著上升,而当Cu-ATSM治疗后,凋亡的HUVECs显著减少(均P<0.05)。Mito-tracker及JC-1染色结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后线粒体的形态明显受到损伤,线粒体功能受损,膜电位下降,而OGD/R+Cu-ATSM组治疗后能够改善损伤的线粒体功能,维持线粒体形态和线粒体膜电位(均P<0.05)。Western blot结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后自噬相关信号通路如ATG5、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表达量增多,而OGD/R+Cu-ATSM组治疗后的自噬相关蛋白表达量较OGD/R组下降(均P<0.05)。免疫荧光结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后LC3Ⅱ的表达显著增多,而OGD/R+Cu-ATSM治疗后的LC3Ⅱ显著减少。结论:Cu-ATSM能够改善HUVECs OGD/R损伤后的线粒体功能,减少HUVECs凋亡,其机制可能是通过抑制自噬实现的。

ROCK通路抑制剂对糖氧剥夺星形胶质细胞的保护作用及机制

目的研究糖氧剥夺(OGD)及ROCK通路抑制对星形胶质细胞的保护作用及机制的影响。方法2022年6月—12月以大鼠CTX TNA2星形胶质细胞系为实验对象,分为对照组A组、糖氧剥夺组B组和法舒地尔组C组。B组构建糖氧剥夺(OGD)干预星形胶质细胞体外模型,C组选用ROCK通路抑制剂法舒地尔(Fasudil)干预模型细胞。分析糖氧剥夺及Fasudil对星形胶质细胞形态、焦亡通路、炎性反应及NRF2/HO-1通路mRNA表达的影响。结果与对照组相比,糖氧剥夺(OGD)干预星形胶质细胞胞体皱缩,延展性减低,细胞伪足减少,细胞体萎缩;转录组测序结果显示,焦亡通路NLRP3、Caspase-1及炎性因子IL-1β、IL-18 mRNA表达相对增加(P<0.05);NRF2、OH-1 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与糖氧剥夺(OGD)干预组相比,法舒地尔(Fasudil)干预后星形胶质细胞延展性增强,细胞伪足增多;转录组测序结果显示,焦亡通路NLRP3、Caspase-1及炎性因子IL-1β、IL-18 mRNA表达降低(P<0.05);NRF2、OH-1 mRNA表达明显升高(P<0.05);所有数据以mean±SEM形式显示,两组比较选用Student’s t-test;多组比较选用one-way ANOVA,多组组内比较选用LSD post-hoc test;P<0.05代表有统计学意义。结论本实验证实,糖氧剥夺(OGD)能够破坏星形胶质细胞形态,抑制NRF2/HO-1信号通路表达;促进焦亡通路及炎性因子表达。法舒地尔(Fasudil)能够改善糖氧剥夺(OGD)干预后星形胶质细胞形态;逆转糖氧剥夺(OGD)干预对星形胶质细胞焦亡通路、炎性反应及NRF2/HO-1通路相关基因NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、NRF2、OH-1 mRNA表达的影响;进而发挥保护作用。

葛花总黄酮通过TLR4/MyD88/NF-κB通路减轻糖氧剥夺对人脑血管内皮细胞损伤的机制

目的 探讨葛花总黄酮(TFG)通过Toll样受体(TLR)4/髓样分化的初级应答(MyD)88/核因子(NF)-κB通路减轻糖氧剥夺(OGD)对人脑血管内皮细胞损伤的机制。方法 通过培养人脑微血管内皮细胞(HBMEC),建立OGD模型细胞模型,将细胞分为对照组(Control)组、OGD模型(OGD)组、OGD模型+TFG低、高剂量(OGD+TFG-L、OGD+TFG-H)组、OGD模型+TFG+pcDNA(OGD+TFG+pcDNA)组和OGD+TFG+TLR4(OGD+TFG+TLR4)组。采用噻唑蓝(MTT)检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;Western印迹检测B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、裂解的胱天蛋白酶(Cleaved cas)3和TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、白细胞介素(IL)-6、IL-10和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达。结果 OGD组细胞活力、SOD、GSH-Px活性明显低于Control组,细胞凋亡率、IL-6、IL-10、TNF-α水平、Bax、Cleaved cas3、TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表达明显高于Control组(P<0.05)。OGD+TFG-L组、OGD+TFG-H组细胞活力、SOD、GSH-Px活性明显高于OGD组,细胞凋亡率、IL-6、IL-10、TNF-α水平、Bax、Cleaved cas3、TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白表达明显低于OGD组(P<0.05)。OGD+TFG+TLR4组细胞活力、SOD、GSH-Px活性明显低于OGD+TFG+pcDNA组,细胞凋亡率、IL-6、IL-10、TNF-α水平、TLR4、Bax、Cleaved cas3蛋白表达明显高于OGD+TFG+pcDNA组(P<0.05)。结论 TFG能够减缓糖氧剥夺诱导的HBMEC凋亡、氧化应激和炎症反应,促进细胞增殖,其作用机制与TLR4/MyD88/NF-κB通路有关。

佛手苷内酯通过调控长链非编码RNA阿片样受体基因表达对糖氧剥夺诱导的PC12细胞损伤的影响

目的研究佛手苷内酯(BG)是否通过调控长链非编码RNA(lncRNA)阿片样受体基因(Oprm1)表达保护糖氧剥夺(OGD)诱导的PC12细胞损伤。方法将PC12细胞分为对照组(Con)、OGD组、OGD+BG低浓度(BG-L)组、OGD+BG中浓度(BG-M)组、OGD+BG高浓度(BG-H)组、OGD+pcDNA组、OGD+pcDNA-Oprm1组、OGD+BG+si-NC组和OGD+BG+si-Oprm1组。试剂盒测定丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。流式细胞术分析细胞凋亡率。Real-time PCR分析Oprm1表达水平。结果与Con组比较,OGD组PC12细胞凋亡率和MDA含量显著升高,Oprm1表达、SOD和GSH-Px活性显著降低(P<0.05)。与OGD组比较,OGD+BG-L组、OGD+BG-M组、OGD+BG-H组PC12细胞凋亡率和MDA含量显著降低,Oprm1表达、SOD和GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。与OGD+pcDNA组比较,OGD+pcDNA-Oprm1组PC12细胞凋亡率和MDA含量显著降低,SOD和GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。与OGD+BG+si-NC组比较,OGD+BG+si-Oprm1组PC12细胞凋亡率和MDA含量显著升高,SOD和GSH-Px活性显著降低(P<0.05)。结论BG可减轻OGD诱导的PC12细胞损伤,其机制与上调lncRNA Oprm1表达有关。

丹酚酸B对糖氧剥夺损伤大鼠海马神经干细胞增殖、凋亡和分化的影响

背景:丹酚酸B具有改善神经损伤、促进神经发生的作用,但其对海马神经干细胞增殖、凋亡和分化的影响仍不清楚。目的:研究丹酚酸B对体外氧糖剥夺损伤大鼠海马神经干细胞增殖、凋亡及分化的影响。方法:取生长状态良好的新生SD大鼠海马神经干细胞,分6组培养:其中5组均于无糖培养基中在含有体积分数为1%O2、5%CO2和94%N2厌氧混合气体的培养箱中缺氧处理150 min,再分别加入0(对照),5,10,20,40 mg/L的丹酚酸B干预细胞,干预4 d后,MTT检测细胞增殖;干预48 h后,流式细胞术检测海马神经干细胞凋亡;干预5 d后,流式细胞术分析神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的比例。以正常培养细胞为正常对照。结果与结论:(1)细胞增殖:与正常对照组比较,对照组神经元干细胞增殖能力明显降低(P<0.01);与对照组相比,丹酚酸B处理组神经干细胞增殖能力逐渐升高,以20,40 mg/L丹酚酸B干预组升高明显(P<0.01);(2)细胞凋亡:与正常对照组比较,对照组海马神经干细胞凋亡率明显升高(P<0.01);与对照组比较,丹酚酸B处理组神经干细胞凋亡率随着丹酚酸B质量浓度的增加而逐渐降低,以20,40 mg/L丹酚酸B干预组降低明显(P<0.01);(3)细胞分化:与正常对照组比较,对照组神经干细胞的胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例升高;与对照组比较,不同质量浓度丹酚酸B处理组神经干细胞的神经元特异性烯醇化酶阳性细胞比例升高,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例下降;(4)结果表明:丹酚酸B可促进氧糖剥夺损伤大鼠海马神经干细胞的增殖,抑制其凋亡,诱导其向神经元分化。

N-乙酰半胱氨酸对糖氧剥夺大鼠皮层星形胶质细胞的保护作用

目的应用体外培养的大鼠脑皮层星形胶质细胞,观察抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对糖氧剥夺导致细胞损伤的作用。方法采用第4代大鼠脑皮层星形胶质细胞,以连二亚硫酸钠和无糖Earle液造成化学性糖氧剥夺(OGD)模型,继而恢复完全培养基模拟体内脑缺血再灌注损伤,分别应用MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出法检测细胞存活率和细胞溶解程度;应用分光光度法测定星形胶质细胞内乳酸水平和Na+-K+ATP酶活性间接反映脑组织能量代谢变化。结果OGD损伤1 h再恢复24 h后,大鼠皮层星形胶质细胞存活率下降,细胞溶解增加,细胞能量代谢障碍。预先给予N-乙酰半胱氨酸可呈剂量相关性的逆转或减轻细胞损伤。结论N-乙酰半胱氨酸对糖氧剥夺/再恢复所致体外培养的大鼠脑皮层星形胶质细胞损伤具有保护作用。

miR-30b对大鼠糖氧剥夺性视网膜神经节细胞损伤的保护作用

背景缺血缺氧损伤是引起大部分视觉系统损害的主要原因，目前尚无有效药物从根本上缓解缺血缺氧带来的损害。研究发现，微小RNA（miR）-30b有助于减轻缺血缺氧导致的心肌损伤，但其对糖氧剥夺的视网膜神经节细胞（RGCs）生存是否有类似的保护作用鲜有文献报道。目的研究重组腺相关病毒介导的miR-30b转染对糖氧剥夺RGCs的保护作用。方法取出生后24h的8只sD大鼠眼球，剥离出视网膜组织以进行RGCs的原代培养，将原代培养的细胞分为重组腺相关病毒（rAAV）-miR对照组、rAAV—miR．30b拟似物组、rAAV—miR-30b抑制物组和PBS组，分别在培养液中添加rAAV—miRNA、rAAV—miR-30b拟似物、rAAV—miR-30b抑制物或PBS培养细胞6d，RGCs：AAV为1：10000。各组细胞分别进行低氧培养箱（37℃，体积分数5％CO2、17％N2、3％O2）联合低糖（葡萄糖质量浓度为1．0g／L）培养液进行培养以建立原代糖氧剥夺RGCs模型，并与正常培养（37℃、5％CO2）的细胞进行对照。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测各组细胞活力，采用免疫荧光染色法检测各组细胞中神经元特异性标志物TubulinⅢ的表达，并计算存活RGCs数目。采用Hoechst／PI染色法检测各组细胞的凋亡和坏死情况。结果培养7d的正常成熟RGCs可见1—3条完整的细长神经元突起及其分支。糖氧剥夺后随着时间延长，培养的RGCs逐渐减少和破坏，突起的主干结构破碎。rAAV·miR-30b拟似物组细胞相对活性分别为3．310±0．162，明显高于rAAV—miR-30b抑制物组和rAAV—miR对照组的0．949±0．141和0．900±0．181，差异均有统计学意义（t=10．508、10．296，均P〈0．001）。存活的RGCs可表达Tubulinm，呈红色荧光。rAAV—miR-30b拟似物组TubulinlI阳性细胞数量为（13．800±1．924）／视野，明显多于rAAV—miR-30b抑制物组的（0．600±0．548）／视野和rAAV—miR对照组的（0．800±1．304）／视野，差异均有统计学意义（t=15．141、14．912，均P〈0．001）。rAAV—miR-30b拟似物组、rAAV—miR对照组和PBS组细胞凋亡率和死亡率的总体比较差异均有统计学意义（F=10．851，P=0．002；F=6．378，P=0．013），rAAV—miR-30b拟似物组细胞凋亡率和死亡率均明显低于rAAV—miR对照组和PBS组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论低氧培养箱联合低糖培养液建立稳定的原代RGCs糖氧剥夺模型；rAAV介导的miR-30b转染可抵抗糖氧剥夺对RGCs的损伤。

苦参碱减轻糖氧剥夺复糖复氧对大鼠脑微血管内皮细胞损伤

为了研究苦参碱对脑缺血再灌注损伤的保护作用,实验通过离体培养鼠脑微血管内皮细胞,采用糖氧剥夺复糖复氧的模型,体外模拟脑缺血再灌注对脑血管内皮的损伤,研究苦参碱对内皮细胞的保护作用.苦参碱减轻糖氧剥夺复糖复氧对脑微血管内皮细胞的损伤,提高内皮细胞的生存率,同时增加损伤细胞线粒体ATP的生成.因此,苦参碱对糖氧剥夺复糖复氧损伤血管内皮细胞具有保护作用.

2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉对星形胶质细胞糖氧剥夺损伤的保护及抗脂质过氧化作用

目的:探讨2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(2-BFI)对星形胶质细胞糖氧剥夺(oxygen-glucosedeprivation,OGD)损伤的保护作用及脂质过氧化的影响。方法:制成星形胶质细胞糖氧剥夺损伤模型,分为正常对照组、OGD组、OGD+2-BFI干预组(浓度分别为0.75、1.5、3、6和12μg/mL),测定星形胶质细胞存活率,选出抗OGD损伤最佳浓度,以该浓度进一步观察2-BFI对脂质过氧化产物丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量的影响。结果:星形胶质细胞在OGD损伤后,不同浓度的2-BFI均能提高细胞存活率,其中1.5μg/mL的效果最佳;予1.5μg/mL 2-BFI干预OGD组能显著降低MDA含量,增加GSH含量。结论:2-BFI能保护星形胶质细胞OGD损伤,且有抑制脂质过氧化的作用。

窖蛋白1对大鼠星形胶质细胞糖氧剥夺损伤的影响

目的探讨糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)对体外培养的大鼠星形胶质细胞窖蛋白1(caveolin-1,Cav-1)的影响。方法原代培养出生24h内SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞,分为对照组和OGD组(给予星形胶质细胞6h的OGD和24h的再灌注损伤,建立OGD损伤模型)。用多重免疫荧光的方法检测星形胶质细胞Cav-1表达,实时荧光定量PCR和Western blot的方法检测星形胶质细胞Cav-1表达的变化。根据小干扰RNA(siRNA)的原理,将Cav-1siRNA转染星形胶质细胞,采用CCK-8的方法检测星形胶质细胞活力。结果大鼠大脑皮质星形胶质细胞Cav-1普遍表达。与对照组比较,OGD组星形胶质细胞Cav-1mRNA和蛋白表达量下降(P<0.05)。siRNA转染后,与对照组比较,OGD组星形胶质细胞活力下降(P<0.05)。结论 SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞Cav-1表达的下调,导致OGD后细胞损伤加重,提示Cav-1对星形胶质细胞具有保护作用。

ghrelin对海马神经干细胞糖氧剥夺性损伤的影响及机制

目的观察ghrelin对糖氧剥夺诱导海马神经干细胞损伤的影响,并探讨核受体辅阻遏子1(N-CoR1)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路在该影响中的作用。方法将细胞随机分为正常对照组、损伤模型组、ghrelin治疗组、GHRP组、LY294002组、siRNA空白对照组、N-CoR1 siRNA组。正常对照组在正常糖含量的培养基、正常氧含量混合气体的普通培养箱中培养24 h,其余各组细胞行糖氧剥夺处理,处理后培养条件同正常对照组。siRNA空白对照组、N-CoR1 siRNA组行糖氧剥夺处理前1 h,培养液更换为含等量转染溶剂Lipofectamine2000或N-CoR siRNA脂质体的培养液,持续转染至糖氧剥夺之后的24 h。ghrelin治疗组在糖氧剥夺处理结束后,将培养液更换为含ghrelin的培养基继续培养24 h。GHRP-6组、LY294002组在糖氧剥夺处理结束后,预先给予ghrelin受体拮抗剂D-Lys ^3-GHRP-6或PI3K抑制剂LY294002处理1 h,再同时给予ghrelin处理,继续培养24 h。收集各组细胞,采用CCK-8法检测海马神经干细胞增殖活力,Western blotting法检测N-CoR1、PI3K、增殖标志蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)及凋亡标志蛋白Bax、Bcl-2。CCK-8实验中ghrelin治疗组ghrelin浓度分别为4、20、100 nmol/L,其余实验中ghrelin浓度均为100 nmol/L。结果与正常对照组比较,损伤模型组海马神经干细胞增殖活力降低,细胞PCNA表达减少、Bax/Bcl-2增大,N-CoR表达明显增多、PI3K表达减少(P均<0.01);与损伤模型组比较,ghrelin治疗组随ghrelin作用浓度增高细胞增殖活力增高(P均<0.01),细胞PCNA表达增多、Bax/Bcl-2减小,N-CoR表达减少、PI3K表达增多(P均<0.01);与ghrelin治疗组(100 nmol/L)比较,GHRP组、LY29400组神经干细胞增殖活力降低,PCNA表达减少、Bax/Bcl-2增大,N-CoR表达明显增多、PI3K表达减少(P均<0.01)。与siRNA空白对照组比较,N-CoR siRNA组神经干细胞增殖活力增高,N-CoR siRNA组PCNA表达增多、Bax/Bcl-2减小,N-CoR siRNA组N-CoR表达减少、PI3K表达增多(P均<0.01)。结论ghrelin可抑制糖氧剥夺诱导的海马神经干细胞损伤,其机制与调节N-CoR/PI3K信号通路有关。

糖氧剥夺/再灌注促进L2.3神经干细胞内源性Huwe1蛋白表达

目的建立L2.3神经干细胞糖氧剥夺/再灌注损伤模型,探讨糖氧剥夺/再灌注是否可以促进L2.3神经干细胞内源性Huwe1蛋白表达。方法将L2.3神经干细胞糖氧剥夺6h,根据不同组别再灌注培养8h、16、24h,建立L2.3神经干细胞/再灌注损伤模型。将体外培养的L2.3神经干细胞分成5组:正常对照组(control组)、糖氧剥夺组(OGD)、糖氧剥夺/再灌注8h组(OGD6h+R8h组)、糖氧剥夺/再灌注16h组(OGD6h+R16h组)、糖氧剥夺/再灌注24h组(OGD6h+R24h组)。Control组:该组L2.3神经干细胞不进行糖氧剥夺处理。OGD组:该组L2.3神经干细胞仅仅进行糖氧剥夺6h。OGD6h+R8h组:该组L2.3神经干细胞经历OGD6h后再灌注培养8h。OGD6h+R16h组:该组L2.3神经干细胞经历OGD6h后再灌注培养16h。OGD6h+R24h组:该组L2.3神经干细胞经历OGD6h后再灌注培养24h。结果与Control组比,OGD组L2.3神经干细胞糖氧剥夺6h后,活细胞比例明显减少[(94.15±3.59)vs(56.05±5.01),P<0.01];与OGD前比,OGD6再灌注8h Huwe1蛋白表达开始增加,OGD6h再灌注16h和OGD6h再灌注24h Huwe1蛋白表达量显著增加,Huwe1蛋白表达的条带明显变粗变浓,OGD6h再灌注16h最明显。结论糖氧剥夺可引起L2.3神经干细胞损伤;糖氧剥夺/再灌注可以促进L2.3神经干细胞内源性Huwe1蛋白表达。

氙气联合亚低温对少突胶质前体细胞糖氧剥夺后的保护作用

目的研究氙气联合亚低温对少突胶质前体细胞(OPCs)糖氧剥夺损伤后的保护作用,探讨氙气对新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的保护机制。方法体外培养大鼠原代OPCs,检测氙气联合亚低温对OPCs糖氧剥夺后凋亡、增殖和分化的影响。结果各组细胞凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.05),其中正常对照组(Ctrl)凋亡率最低为(6.3±1.52)%,而OGD对照组(OGD Ctrl)凋亡率最高为(70.3±4.72)%,氙气组(Xe)和亚低温组(HT)凋亡率分别为(27.3±3.05)%、(31.6±4.5)%,显著低于OGD对照组,比较差异有统计学意义(P<0.05),联合治疗组(Xe+HT)凋亡率为(15.6±2.51)%,低于氙气低温组或亚低温组,比较差异有统计学意义(P<0.05);各组OPCs增殖率比较差异无统计学意义;正常对照组细胞呈健康生长,有明显的三级以上分支的较长网状突起形成,计算成熟细胞率为(81.0±4.58)%;OGD对照组细胞细胞突起短少而紊乱,次级以上分支减少,成熟细胞率为(14.6±3.51)%,OGD对照组与正常对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。氙气组成熟细胞率(43.6±3.51)%比OGD对照组高,低于亚低温组(53.3±3.21)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。联合治疗组成熟细胞率(64.6±4.16)%显著高于单用氙气或亚低温组(P<0.05)。结论氙气联合亚低温治疗能保护OPCs耐受缺氧缺血性损伤的影响,可能是其对HIE的神经保护机制之一。

细胞周期抑制剂对糖氧剥夺诱导神经元凋亡的保护机制研究

目的:探讨细胞周期抑制剂Roscovitine(Ros)对糖氧剥夺(OGD)诱导的鼠大脑皮质神经元凋亡的保护作用及可能机制。方法:体外培养大鼠皮质神经元,随机分为对照组、OGD1h后恢复糖氧供给(OGD/R)3h、6h、12h、24h组及Ros(100μM)组。Western Blot检测各组神经元磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(p-Rb)和E2F1的表达情况;免疫荧光细胞化学染色观察OGD/R12h组及Ros组神经元p-Rb表达;TUNEL法检测OGD/R12h组及Ros组神经元凋亡情况。结果:OGD/R各组神经元p-Rb及E2F1的表达均较对照组增高(P<0.05),12h达最高;Ros组p-Rb及E2F1的表达减少,少于OGD/R12h组(P<0.05);Ros组p-Rb和TUNEL阳性细胞率均低于OGD/R 12h组(P<0.01),两组中大部分TUNEL阳性细胞与p-Rb表达共定位。结论:Ros可能通过抑制Rb磷酸化及E2F1介导的凋亡机制来减少缺血缺氧后的神经元凋亡。

体外培养大鼠海马神经元糖氧剥夺/复氧轴突损伤模型的建立

目的建立体外培养大鼠海马神经元糖氧剥夺/复氧轴突损伤模型。方法取体外培养7d的海马神经元,分为正常对照组和糖氧剥夺/复氧组。后者分别在糖氧剥夺0.5、1.0、1.5h再复糖复氧。常氧状态下检测各组复氧后1、5、24、48、72h培养液中的LDH活性,并观察神经元形态和轴突长度的变化。结果糖氧剥夺/复氧后的神经元折光性降低,胞体肿胀,并且轴突逐渐变短,同时LDH水平随时间延长增加。其中糖氧剥夺0.5h再复氧组效果最佳,其轴突缩短明显且神经元存活率较高。结论成功建立了体外培养SD大鼠海马神经元糖氧剥夺/复氧轴突损伤模型。