无嘌呤无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1的研究进展

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶 /氧化还原因子 1(APE/Ref- 1)具有修复 DNA损伤、影响氧化还原反应及调节转录因子DNA结合活性等功能 ,对细胞的生存有重要作用。近年来有关 APE/Ref- 1的研究在其基因、功能、分布以及与某些疾病尤其是神经系统疾病和肿瘤之间的关系等方面都取得了长足的进展 。

氧化还原因子1促进乳鼠心肌成纤维细胞增殖

目的:研究氧化还原因子1(redox factor 1,REF1)对乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及其可能的机制。方法:为证实REF1在乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用,构建重组Ref1野生型和突变型的腺病毒载体,感染乳鼠心肌成纤维细胞。通过RT-PCR和Western印迹检测Ref1以及与胶原合成相关的基因表达的改变,通过免疫荧光检测REF1核转位,利用MTT和流式细胞仪分析细胞增殖和细胞周期,用电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测REF1对转录因子活化蛋白1(activator protein 1,AP1)的DNA结合能力的影响。利用含25 mmol/L的葡萄糖培养基模拟高糖环境,观察对乳鼠心肌成纤维细胞增殖及REF1表达与活性的影响。结果:MTT比色法显示,感染野生型Ref1重组腺病毒的细胞在490 nm处的光密度值明显高于对照病毒组(0.671±0.044vs0.364±0.007,n=6,P<0.01)。流式细胞仪对细胞周期的分析表明,野生型Ref1能明显增加S期细胞的百分率(16.8%±0.62%vs9.04%±0.43%,n=3,P<0.05)。RT-PCR检测发现,野生型Ref1促进细胞Ⅰ型胶原(collagen I,ColⅠ)和Ⅲ型胶原(collagenⅢ,ColⅢ)mRNA表达增多,但突变型Ref1对细胞的增殖和胶原的合成均没有明显影响。EMSA实验结果显示,感染野生型Ref1重组腺病毒的细胞AP1的DNA结合能力增强。高糖培养基培养乳鼠心肌成纤维细胞同样能增强AP1的DNA结合能力。高糖培养虽然对Ref1的表达水平没有影响,但增强了细胞中REF1的核转位,促进了细胞的增殖。结论:REF1促进乳鼠心肌成纤维细胞的增殖和胶原合成,其机制可能是通过上调AP1的DNA结合能力。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1在肿瘤发生发展及治疗中的作用研究进展

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(APE/Ref-1)是一种具有DNA修复和转录调控双重功能的蛋白质,其在肿瘤细胞中的高表达与肿瘤发生发展紧密相关。激素如17β-雌二醇可促进APE1/Ref-1的分泌,影响其表达。APE1/Ref-1抑制剂,如C10和E3330,已在实验中显示了抑制肿瘤细胞增殖和增强化疗药物敏感性的潜力,但APE1/Ref-1抑制剂的临床应用安全性和最佳时机需更多研究探讨。

纳洛酮干预对大鼠脑出血后血肿周围神经细胞中氧化还原因子-1表达与凋亡的影响

目的 :观察盐酸纳洛酮对脑出血后血肿周围神经细胞中氧化还原因子 1(redoxfactor 1Ref 1)表达的影响。方法 :应用立体定向技术 ,将SD大鼠自体不凝血 5 0 μl 注入其尾状核区制备脑出血模型 ,将动物随机分为正常对照组 ,假手术组、出血组和纳洛酮干预组 ,并分别在不同时间点断头取脑 ,连续切片作Ref 1和TUNEL (terminaldeoxynucleotidyltrans ferase [TdT ] mediateddeoxyuridinetriphosphate[dUTP] biotinnickendlabeling)免疫组化染色。结果 :经盐酸纳洛酮干预后 ,血肿周围神经细胞中Ref 1表达与脑出血相对应组比较 ,在 12h影响不明显 ,4 8h能增加Ref 1表达 (P <0 .0 1) ;72h亦能增加Ref 1表达 (P <0 .0 5 ) ;盐酸纳洛酮干预性治疗后 ,血肿周围神经细胞中TUNEL阳性细胞数与脑出血相对应组比较 ,在 12h明显影响 ,4 8h能明显减少凋亡 (P <0 .0 5 ) ;72h更明显 (P <0 .0 1)。结论 :盐酸纳洛酮能通过提高ICH缺血半暗带区Ref 1表达等途径 ,增加修复氧化损伤的DNA能力 ,减少细胞凋亡 。

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.

无嘌呤无嘧啶位点/氧化还原因子-1在缺血神经元DNA损伤中的修复作用

神经元缺血后 ,损伤因素可使其发生程序性细胞死亡 ,此过程的起始阶段会出现包括碱基缺失、碱基改变和DNA链断裂在内的基因损伤。而无嘌呤无嘧啶位点 /氧化还原因子 1则可能针对此过程进行基因修复。此外 ,它还可能参与调节调控激活物蛋白 1家族成员 ,通过其所发挥的转录因子作用间接地影响神经元DNA修复。

大鼠脑出血后氧化还原因子-1表达与细胞凋亡相关性的研究

目的探讨脑出血(ICH)后血肿周围组织中氧化还原因子1(Ref1)表达与细胞凋亡的关系。方法应用立体定向技术,将SD大鼠自体不凝血50μl注入其尾状核区制备ICH模型,分别在不同时间点断头取脑,连续切片作Ref1免疫组化染色和原位末端标记(TUNEL)染色;观察各时间点Ref1表达及TUNEL阳性细胞数,并进行相关性分析。结果ICH后血肿周围组织中TUNEL阳性细胞与Ref1表达呈负相关(r=-0.745,P<0.05),且Ref1表达下降谷底时间明显早于细胞凋亡高峰的时间。结论ICH后血肿周围组织中细胞凋亡增加与Ref1表达减少可能有关。

缺氧缺血性新生大鼠脑皮质氧化还原因子-1蛋白的表达

目的 :探讨新生大鼠脑组织缺氧缺血后 ,氧化还原因子 -1(APE/Ref-1)蛋白在脑皮质不同时相的表达及其意义。方法 :将新生7日龄SD大鼠制成缺氧缺血性脑损伤(HIBD)动物模型 ,采用免疫组织化学方法及原位缺口末端标记 (TUNEL)法分别观察正常对照组、假手术组及缺氧缺血1、3、6、12、24、48小时APE/Ref-1蛋白及神经细胞凋亡变化 ,分析两者关系。结果 :氧化还原因子 -1蛋白在正常对照组、假手术组及右侧大脑半球神经细胞核广泛表达 ;而缺氧缺血组脑皮质区该蛋白表达随缺血时间的延长而下降 ,且各时间点间差异显著。脑皮质区凋亡阳性细胞表达脑皮质区与APE/Ref-1相反 ,其随缺血时间的延长逐渐增多 ,并在24小时达到高峰。结论 :新生大鼠脑组织缺氧缺血后 ,脑皮质区神经元APE/Ref-1蛋白表达减少,凋亡细胞表达增加,提示APE/Ref-1蛋白减少和DNA修复功能失败可能与脑缺氧缺血后神经细胞凋亡的发生有关。

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤氧化还原因子-1蛋白表达及意义的研究

目的 探讨新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后,氧化还原因子-1 (APE/Ref 1)蛋白在大脑皮质不同时相的表达及其与神经细胞凋亡的关系。方法 将新生7日龄SD大鼠制成HIBD动物模型,采用免疫组织化学方法及原位缺口末端标记(TUNEL)法分别观察正常对照组、假手术组及缺氧缺血1, 3, 6, 12, 24, 48hAPE/Ref 1蛋白及神经细胞凋亡变化。结果 APE/Ref 1蛋白在正常对照组、假手术组神经细胞核内广泛表达,两组间差异无显著性(P>0. 05);而缺氧缺血组大脑皮质该蛋白表达随缺血时间的延长而下降,且各时间点间差异显著(P<0. 05)。大脑皮质凋亡阳性细胞表达与APE/Ref 1相反,其随缺血时间的延长逐渐增多,并在24h达到高峰,均高于正常对照组及假手术组(P<0. 05)。结论 新生大鼠脑组织缺氧缺血后,大脑皮质神经元APE/Ref 1蛋白表达减少, 凋亡细胞表达增加,提示APE/Ref 1蛋白减少和DNA修复功能失败可能与脑缺氧缺血后神经细胞的凋亡发生有关。

APE/Ref-1在中枢神经系统氧化应激反应中的保护作用

化学性质活泼的自由基(freeradicals)在保持产生和清除平衡的稳衡性动态下能履行正常的生理功能,但超过生物体的清除能力则可导致多种疾病.无嘌呤无嘧啶核酸内切酶氧化还原因子1(apurinicapyrimidinicendonucleaseredoxfactor1,APERef1)是一种体内分布广泛的多功能蛋白质,通过修复DNA的无嘌呤无嘧啶(apurinicapyrimidinic,AP)部位参与DNA的碱基切除修复(baseexcisionrepair,BER).APERef1还可通过还原许多转录因子的半胱氨酸残基使之易于与DNA结合而调控真核细胞的基因表达.APERef1的抗细胞凋亡作用使其在自由基所致中枢神经系统病变如脑缺血再灌注损伤、神经退行性病变、脑动脉粥样硬化中发挥了重要作用.

APE/Ref1在H_2O_2诱导耳蜗螺旋神经节细胞氧化损伤过程中的表达

目的研究氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidimic endonuclase/redox factor1,APE/Ref-1)在过氧化氢(H2O2)诱导耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGCs)氧化损伤过程中的表达。方法原代培养离体大鼠SGCs,采用免疫荧光和Western blot方法检测APE/Ref-1在H2O2诱导SGCs氧化损伤过程中的表达。台盼蓝染色法计算SGCs氧化损伤过程中的死亡率。结果APE/Ref-1在体外正常培养SGCs细胞质和细胞核均有表达,细胞核较强。H2O2浓度≥60μmol/L时,SGCs死亡率显著升高,APE/Ref-1在细胞核表达明显减弱,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论APE/Ref-1在氧化环境下SGCs细胞核表达减少,细胞死亡率升高,提示氧化环境下细胞活性降低可能与APE/Ref-1表达减少有关。

靶向APE/Ref-1基因沉默及过表达对MRC-5细胞氧化损伤的影响

目的研究人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(APE/Ref)-1基因沉默及过表达对氧化损伤人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞的影响,验证APE/Ref-1对氧化损伤MRC-5细胞的保护作用。方法过氧化氢(H2O2)处理MRC-5细胞,建立细胞衰老模型,分别用黄芪多糖和棉酚使APE/Ref-1基因表达上调和下调,CCK-8检测细胞存活率,Western印迹检测APE/Ref-1蛋白表达,免疫荧光检测MRC-5细胞8-羟基-2′脱氧鸟苷(8-OHdG)含量,检测DNA氧化损伤情况。结果700μmol/LH2O2处理细胞可建立细胞损伤模型;200mg/L黄芪多糖和20μmol/L棉酚分别处理细胞可建立APE/Ref-1基因表达上调和下调模型;CCK-8检测细胞活力表明APE/Ref-1基因表达下调组最低,上调组最高;Western印迹检测表明棉酚处理组APE/Ref-1蛋白表达含量最少,黄芪多糖处理组最多;免疫荧光表明,与对照组相比,H2O2模型组8-OHdG的表达明显增高,黄芪多糖处理组表达相对增高,棉酚处理组表达最多。结论棉酚和黄芪多糖分别可使目的基因表达下调和上调,H2O2处理可使MRC-5细胞产生氧化损伤;随目的基因表达增多,8-OHdG的表达水平下降;提高氧化损伤的MRC-5细胞中该基因的表达可以减轻其氧化损伤程度并抑制其凋亡。

APE/Ref-1与细胞氧化损伤研究综述

人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor-1,APE/Ref-1)是一类分布广泛的生物大分子蛋白质,可控制细胞分化、凋亡和增殖等,在多个领域发挥着重要的作用。近年来,APE/Ref-1在抗肿瘤、抗氧化损伤等方面研究获得了许多新的研究成果。本文综述了近年相关内容的研究进展,并对细胞氧化损伤及其研究方法进行了综述。

黄芪多糖对过氧化氢诱导的MRC-5细胞氧化损伤的保护作用

目的研究黄芪多糖(APS)在过氧化氢(H2O2)诱导的MRC-5人胚肺成纤维细胞氧化损伤细胞模型中,对无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1(APE/Ref-1)和硫氧还蛋白(TRX)水平的影响,分析APS在氧化损伤过程中对MRC-5细胞的保护机制。方法将培养的MRC-5细胞随机分组:空白对照组、不同浓度H2O2组、(200、400、800)mg/L APS处理组。通过H2O2作用于MRC-5细胞建立细胞氧化损伤模型,使用MTT法检测H2O2对MRC-5细胞的增殖抑制率,待H2O2作用的MRC-5细胞氧化损伤模型建立后,用最佳H2O2浓度与不同浓度的APS共同作用于MRC-5细胞,确定APS对氧化损伤MRC-5细胞的最佳作用浓度;采用免疫荧光检测8-羟脱氧鸟苷(8-OHd G)含量反映MRC-5细胞DNA氧化损伤情况;应用流式细胞术检测MRC-5细胞的凋亡;采用反转录PCR分析TRX和APE/Ref-1 mRNA的水平;Western blot法检测TRX和APE/Ref-1蛋白水平的变化。结果实验表明,H2O2孵育MRC-5细胞24 h,可诱导细胞损伤,使细胞存活力下降,且具有浓度依赖性。800μmol/L H2O2浓度时建立细胞氧化损伤模型。与H2O2引起氧化损伤的模型组相比,200 mg/L的APS明显抑制H2O2引起的APE/Ref-1、TRX蛋白表达下调,降低8-OHd G含量,抑制MRC-5细胞凋亡,细胞存活率明显升高。结论 H2O2引起MRC-5细胞氧化损伤,APS促进氧化损伤的MRC-5细胞APE/Ref-1和TRX的表达,APS减轻MRC-5细胞的氧化损伤并抑制其凋亡。

APE/Ref-1基因单核苷酸多态性与肿瘤关系的研究进展

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)是一个生物大分子功能复合体,既具有脱嘌呤/脱嘧啶位点(AP位点)核酸内切酶活性,又具调节转录因子的活性。其分布及单核苷酸多态性为近年来研究的热点。探讨其单核苷酸多态性与肿瘤的关系将有助于对肿瘤的防治。

APE/Ref-1和Trx1在宫颈癌中的表达及相关性研究

目的:探讨宫颈癌中氧化还原因子1(APE/Ref-1)和硫氧还蛋白1(Trx1)的表达及其与宫颈癌相关临床参数的关系。方法采用免疫组化S-P法检测9例正常宫颈组织、20例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、38例宫颈癌中APE/Ref-1和Trx1的表达水平,分析各自表达水平与宫颈癌相关临床参数的关系。结果在正常宫颈组织中APE/Ref-1和Trx1均呈低表达,分别为22.2%、12.5%;在宫颈上皮内瘤变(CIN)中均呈中等量表达,分别为65.0%、55.0%;在宫颈癌组织中均呈高表达,分别为84.2%、89.4%;APE/Ref-1的表达与宫颈癌的临床分期、病理分级有关,Trx1的表达与宫颈癌的病理分级、淋巴结转移有关;在宫颈癌组织,APE/Ref-1和Trx1蛋白的表达呈正相关,差异有统计学意义(r=0.557,P=0.000)。结论 APE/Ref-1和Trx1可能共同参与了宫颈癌的发生、发展。

Ape/Ref-1与中枢神经系统疾病的研究进展

无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1(apurinic/apyrim id inic endonuclease/redox-factor1,Ape/Ref-1)是一种在体内分布非常广泛的蛋白质,具有修复损伤的DNA,调节氧化还原反应,参与细胞信号转导等多种功能,在维持基因组的完整、调节基因表达、细胞保护等许多方面发挥重要作用。本文着重论述Ape/Ref-1的结构和生物学功能,及其在中枢神经系统肿瘤、损伤等疾病中的作用。

大肠癌Ref-1/APE的表达特点及其意义

目的探讨大肠癌氧化还原因子-1(redoxfactor-1,Ref-1),又称脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyri-midinicendonuclease,APE),在大肠癌的表达特点及其与血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)和血管密度的关系。方法应用免疫组化S-P法检测110例大肠癌和40例非癌区大肠组织中Ref-1/APE和VEGF的表达,采用血管内皮特异标记物CD31标记并计数肿瘤微血管密度(microvesseldensity,MVD),最后分析Ref-1/APE与VEGF和MVD的关系。结果所有大肠癌和非癌区大肠组织都有Ref-1/APE表达,但是其在细胞内的定位有所不同。40例非癌区大肠组织细胞核都有Ref-1/APE表达,仅5例有胞质表达(5/40,12·5%);而110例大肠癌中有79例(79/110,71·81%)细胞质有Ref-1/APE表达,比例显著高于非癌区大肠组织(P<0·01)。而且细胞质Ref-1/APE阳性表达的大肠癌较无细胞质表达者VEGF阳性率显著增加(P<0·05),MVD也显著增高(P<0·05)。结论大肠癌Ref-1/APE移位于细胞质的异常表达可能涉及大肠癌的发生,并且可能与VEGF表达和肿瘤血管生成有关。