茶树氧甲基转移酶基因密码子偏好性分析

[目的]茶树氧甲基转移酶参与多种物质的甲基化进程,催化形成的产物具有抗氧化、抗过敏等多种功效,参与合成的木质素不仅影响茶叶品质而且在茶树抵抗不利生长环境方面也发挥着重要作用。通过对茶树氧甲基转移酶基因(CsOMT)密码子偏好性的分析,明确其密码子使用特性及更适外源表达受体等,为优化基因表达和推进后续育种工作提供理论依据。[方法]利用NCBI获取拟南芥氧甲基转移酶蛋白质序列,通过TPIA网站下载茶树染色体水平基因组的蛋白质序列和编码序列。运用TBtools比对筛选出该基因的CDS序列,运用CodonW、SPSS、MEGA、GraphPad Prism 8等分析软件及程序对该基因密码子进行了密码子使用偏好分析,判断影响密码子偏好性的因素,筛选出最优密码子,分析得到更适合的外源表达受体。[结果]分析该基因碱基组成发现,GC1和GC3平均值分别为51.62%和47.95%,GC2平均值为37.30%,仅第2位碱基偏好性较大,CsOMT密码子CAI平均值为0.211,远小于1,而ENC平均值为55.41,偏大,综合以上参数可知该基因密码子偏好性较弱;中性绘图分析显示GC12与GC3的回归曲线斜率为0.257,R2=0.282 7,表明GC12与GC3相关性较弱;ENC-plot分析显示大多数基因分布在曲线下方,ENC比值的绝对值大于0.05的频率是0.869;从PR2-plot分析图中可以看出多数基因偏离中心点,且T出现的频率高于A,C/G碱基出现的频率差异不大,C碱基出现频率略高。对GC1、GC2、GC3、GCall、ENC等数据进行双变量相关性分析,发现第3位碱基与第1、2位碱基的组成密切相关,而第1位和第2位碱基相关性较低,且ENC值与GC1呈极显著正相关,系数为0.273,说明该基因密码子第1位碱基的成分对密码子偏好性影响较大。通过分析RSCU和ΔRSCU确定了13个最优密码子。筛选出与大肠杆菌、酵母菌、拟南芥、烟草4种模式作物的密码子使用频率差异较大的密码子,个数分别是15个、6个、1个、0个。[结论]CsOMT密码子偏好性同时受选择压力和突变压力的影响,且自然选择压力的影响更大。最优密码子为UUG、GUU、GUG、GCA、CCA、UCU、UCA、AGU、UGC、CAA、AGG,GGA、GGG,偏好使用A/T(U)结尾的密码子。酵母菌和烟草更适合CsOMT做外源表达受体。

缺氧/复氧经DNA甲基转移酶途径减弱人绒毛外滋养细胞的迁移和侵袭

目的探讨缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)对人绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblast,EVT)侵袭能力的调控机制。方法体外培养EVT永生化细胞系HTR-8/SVneo、早孕胎盘绒毛分离的原代EVT细胞和绒毛外植体,1%O2和20%O2浓度转换条件下模拟EVT细胞侵入子宫时的H/R环境,Western blot、免疫荧光技术检测细胞侵袭等关键因子的表达,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭。结果经H/R诱导后,HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力减弱,体外培养的绒毛外植体的外延能力和分离的原代EVT细胞迁移、侵袭能力均减弱;H/R条件下,HTR-8/SVneo细胞中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9,整合素integrin-β1和integrin-α5蛋白水平降低(P<0.05),DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)的蛋白表达亦下调(P<0.01);H/R条件下,原代EVT细胞中上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的正调控因子Slug、Snails等被抑制(P<0.05),上皮细胞标志因子E-cadherin表达上升(P<0.01),MMP-2和-9、integrin-β1和-α5蛋白水平下降(P<0.05),细胞侵袭能力下降并伴随DNMT1、DNMT3A的表达下降(P<0.05)。HTR-8/SVneo细胞中过表达DNMT1、DNMT3A和DNMT3B可促进间质型标志因子N-cadherin、MMP-2和-9的蛋白表达上调(P<0.05)。结论H/R通过DNMTs调控MMP-2/9等EMT相关因子的表达从而减弱EVT细胞迁移和侵袭能力。

板栗咖啡酸氧甲基转移酶基因CmCOMT的克隆及原核表达

该研究根据板栗(Castanea mollissima Bl.)cDNA文库分析得到EST序列,采用RT-PCR技术,克隆板栗咖啡酸氧甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase,COMT)基因全长cDNA(CmCOMT),分析其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究,为板栗木质素合成关键酶基因CmCOMT的生物学功能研究与应用奠定基础。结果表明:(1)CmCOMT基因(GenBank登录号为KU365322)具有一个1 098bp开放阅读框(ORF),共编码365个氨基酸,推测蛋白分子质量为39.684 9kD,理论等电点为5.83,具有植物SAM依赖甲基转移酶的典型特征。(2)CmCOMT核苷酸序列及其编码氨基酸序列与垂枝桦(Betula pendula)和白桦(Betula platyphylla)的相应序列一致性均在90%以上;同源建模表明,CmCOMT的3D模型与苜蓿(Medicago sativa)MsCOMT的蛋白结构相似,推测其可能与MsCOMT具有相似的功能;系统发育树分析显示,CmCOMT与其他植物COMTs具有相同的进化祖先,与桦木科植物物种亲缘关系最近。(3)SDS-PAGE电泳分析表明,CmCOMT蛋白最佳诱导表达条件为0.3mmol/L IPTG在25℃下诱导6h,蛋白分子量约为44kD,其主要以可溶性蛋白的形式存在。

精神分裂症攻击行为与儿茶酚氧位甲基转移酶基因多态性

目的研究中国昆明地区汉族人群儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)基因Val158Met多态性与精神分裂症攻击行为的相关性。方法采用外显攻击行为量表(OAS)测量88例符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DSMⅣ)和中国精神障碍分类与诊断标准第3版(CCMD3)的精神分裂症患者;并应用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)的方法检测他们的COMT基因多态性。结果攻击行为患者与无攻击行为患者各基因型及基因型频数分布无显著差异;但分性别后发现:有攻击行为男性患者与无攻击行为男性患者等位基因频率比较有显著性差异(P<0.05),将158Met作为危险因素,OR值等于4.55,95%CI为1.36～15.19。而有、无攻击行为的女性患者间的等位基因频数比较无显著差异(P>0.05)。结论COMTVal158Met基因多态性与精神分裂症的攻击性行为有关,中国昆明地区的男性患者的低活性等位基因与攻击性行为显著相关联。

石蒜儿茶酚氧位甲基转移酶基因克隆与原核表达

采用同源克隆与RACE相结合的方法,首次从石蒜叶片中克隆到可能与加兰他敏生物合成相关的儿茶酚氧位甲基转移酶基因,命名为LrCOMT。核酸序列分析显示,该cDNA全长1 246bp,开放阅读框1 101bp,编码366氨基酸。氨基酸序列分析与比对发现,LrCOMT编码的氨基酸序列具有COMT蛋白的特征区域,且与鸢尾、玉米、烟草等植物COMT的同源性大于60%。将LrCOMT基因连接到原核表达载体pET-29a上,转化大肠杆菌BL21(DE3)的原核表达结果显示,重组蛋白受IPTG诱导表达,分子量大小约为40kD,与已报道的其他植物COMT大小基本一致。

儿茶酚氧位甲基转移酶基因多态性与精神分裂症关联分析

目的 探测中国汉族人儿茶酚O 甲基转移酶(COMT)基因第 108位密码子由缬氨酸到甲硫氨酸突变的多态性与精神分裂症的关系。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)技术,检测 309例精神分裂症患者(患者组)和 367名正常人(对照组)的COMT基因多态性。结果(1)患者组COMT等位基因A频率(23. 78% )低于对照组( 30. 93% ),等位基因G频率 (76. 22% )高于对照组(69. 07% ),差异均有非常显著性(P=0. 003)。按性别比较,等位基因A和G频率在两组男性之间的差异均具显著性(P=0. 02),而两组女性间的差异则不具显著性(P=0. 073)。(2)COMT基因A/A基因型频率两组的差异无统计学意义(P=1. 000, P=0. 815).患者组及其男性和女性的A/G基因型频率(分别为 39. 80%、40. 75%和 39. 35% )均低于对照组(分别为 53. 68%、55. 76%和 51. 98% );P=0. 000,P=0. 006,P=0. 018。患者组及其男性和女性的G/G基因型频率(分别为 56. 32%、57. 15%和 55. 48% )均高于对照组(分别为 42. 23%、41. 21%和 43. 07% );P=0. 000、P=0. 004和P=0. 020。结论 该结果提示,在我们研究的样本中COMT108Met多态性与精神分裂症关联。所以,不能排除中国汉人 22号染色体存在精神分裂症易患性基因的可能性。

SPR生化分析仪对6-氧甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的检测

6-氧甲基鸟嘌吟-DNA甲基转移酶(简称MGMT)是一种重要的DNA损伤修复酶,组织中MGMT活性水平的检测可以为肿瘤的早期预防和治疗中化疗方案的确定提供依据。我们利用基于表面等离子体谐振(SPR)生物传感器原理研制成的SPR-2000型生化分析仪对MGMT的基因片段进行了检测,然后采用配套的软件系统对实验数据进行处理,获得检测曲线;再对检测曲线进行温度补偿修正后便获得了杂交反应曲线,SPP-2000型生化分析仪可以检测1.18×10^(-10)mol/L浓度的MGMT核酸样品,为进一步进行临床检测的研究奠定了基础。

茶树氧甲基转移酶基因的克隆及原核表达

获得了一类茶树氧甲基转移酶基因cDNA全长并构建了该基因的原核表达载体。以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得氧甲基转移酶(O-methyltransferase)基因cDNA全长1 280 bp,其开放阅读框为1 068 bp,编码355个氨基酸,推测的蛋白分子量为39.1 kD,理论等电点为5.68。其氨基酸序列与葡萄和蓖麻氧甲基转移酶基因相似性分别为73%、71%。将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21后诱导重组蛋白的表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测到1条与预测融合蛋白分子量相符的外源蛋白。

高效液相色谱法测定人体红细胞中儿茶酚氧位甲基转移酶的活性

采用高效液相色谱紫外检测法测定人体红细胞中儿茶酚氧位甲基转移酶 (COMT)的活性。以 3,4 二羟基苯甲酸 (DBA)作为酶反应底物 ,S 腺苷甲硫氨酸 (SAM)作为甲基供体 ,在镁离子的存在下 ,将SAM上的甲基转移到DBA 3位的氧上。色谱法测定反应产物 4 羟基 3 甲氧基苯甲酸 (4 OH 3 MBA)的生成量。人体红细胞中COMT活性的线性范围在 1U/mL～ 6 0U/mL ,最低检测限为 0 5U/mL(S/N≥ 5 ) ,方法的精密度良好 (平均RSD <10 % )。

首发抑郁障碍认知功能与儿茶酚氧位甲基转移酶基因多态性的关联分析

目的:探讨首发抑郁障碍认知功能与儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)基因多态性的关系。方法:应用聚合酶链反应及聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,检测40例首发抑郁障碍患者和40例健康志愿者COMT基因多态性分布,并进行神经心理学评估。结果:COMT等位基因与基因型频率在两组间差异无显著性(均P>0.05);患者组神经心理学测验成绩在COMT等位基因、基因型之间差异均无统计学意义(均P>0.05);患者组持续错误数与基因型A/A呈负相关(r=-0.351,P=0.026),与等位基因G呈正相关(r=0.351,P=0.026)。结论:首发抑郁障碍的认知功能的改变与COMT基因多态性可能存在相关性。

死亡相关蛋白激酶1、KLF4、6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶甲基化状态检测及与宫颈癌人乳头瘤病毒16感染的关系

目的检测宫颈癌组织死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)、KLF4、6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子区域甲基化状态,初步探讨其甲基化状态与宫颈癌人乳头瘤病毒16(HPV16)感染的关系。方法选取宫颈癌患者103例为宫颈癌组,另选取同期年龄相匹配的慢性子宫颈炎患者110例为对照组。检测2组宫颈脱落组织DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化状态。通过人乳头瘤病毒检测HPV16感染情况,分析宫颈癌组织DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化与HPV16感染相关性。结果与对照组相比,宫颈癌组患者HPV16感染阳性率升高,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,宫颈癌组DAPK1、KLF4、MGMT基因异常甲基化率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。分化程度低、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移及有远处转移患者宫颈癌组织DAPK1、KLF4、MGMT甲基化率高于分化程度高、中及TNM分期Ⅰ~Ⅱ、无淋巴结转移、无远处转移患者,差异有统计学意义(P<0.05)。与HPV16感染阴性相比,HPV16感染阳性患者中APK1、KLF4、MGMT甲基化比例升高,差异有统计学意义(P<0.05)。HPV16感染情况与APK1、KLF4、MGMT甲基化相关(r=0.454,0.497,0.307,P<0.05)。结论HPV16感染可能与APK1、KLF4、MGMT甲基化有关,HPV16感染可能通过影响APK1、RAR-β、MGMT基因甲基化促进宫颈癌的发展。

高效液相色谱-电化学法测定人红细胞儿茶酚氧位甲基转移酶活性

目的:建立高效液相色谱-电化学法测定人体红细胞儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)活性。方法:以S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,3,4-二羟基苯甲酸(DBA)为酶反应底物,COMT催化DBA生成4-羟基-3-甲氧苯甲酸(4-OH-3-MBA),高氯酸沉淀蛋白后直接进样,电化学检测4-OH-3-MBA;以每毫克蛋白每分钟生成的4-OH-3-MBA的pmol数表示COMT活性。色谱柱为Nova-pak C18(3.9mm×150mm,4.0μm);流动相为0.1mol·L-1磷酸二氢钠缓冲液(内含EDTA0.15mmol·L-1)-甲醇(85∶15),pH3.2,流速0.8mL·min-1,柱温25℃;工作电位+900mV。结果:4-OH-3-MBA在0.2～6μmol·L-1范围内线性良好,r=0.9997(n=6),4-OH-3-MBA最低检测浓度为0.02μmol·L-1(S/N≥3);4-OH-3-MBA0.2,2,6μmol·L-1浓度的日内、日间精密度RSD在1.09%～7.71%之间,回收率在96.0%～100.3%之间。结论:本法准确、灵敏、简便,适于红细胞COMT活性测定。

注意缺陷多动障碍执行功能与儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因的关联分析

目的探讨注意缺陷多动障碍(attention-deficit hyperactivity disorder,ADHD)执行功能与儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase,COMT)基因rs4680多态性位点的关系。方法采用威斯康星分类测验(Wisconsin card sorting test,WCST)对114例符合美国精神障碍诊断与统计手册第四版(mental disorders versionⅣ,DSM-Ⅳ)诊断标准的ADHD儿童与76名正常对照组进行执行功能评估,并应用限制性片段长度多态性的方法进行COMT基因rs4680多态性位点分析。结果 ADHD组的WCST总应答数、完成第一个分类所需应答数和持续性应答数均明显高于正常对照组(P<0.05),而完成分类数明显低于正常对照组(P<0.01)。ADHD患者中不同基因型组之间WCST概念化水平百分数差异具有统计学意义(P=0.01),A/A组高于G/A组和G/G组(P<0.05),G/A组也高于G/G组但无统计学意义(P>0.05)。不同基因型组间WSCT其他指标的差异均无统计学意义(P≥0.05)。ADHD组和正常对照组之间COMT基因rs4680多态性基因型及等位基因的分布差异均无统计学意义(P>0.05)。结论本研究未发现COMT基因rs4680多态性与ADHD存在关联,但rs4680多态性可能与ADHD的某些执行功能指标有关。

茶树咖啡酸氧甲基转移酶基因的克隆及原核表达

以从茶树叶子中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR利用RACE技术,得到咖啡酸氧甲基转移酶(caffeic acid o-methyltransferase,COMT)基因全长1 381bp,其开放阅读框为1 092bp,编码393个氨基酸,推测的蛋白分子量约为39.661 9ku,理论等电点为5.66,在GenBank的登录号为HM204933。其核苷酸序列与欧洲白桦、苎麻、中果咖啡和毛果杨的COMT基因相似性分别为80%、78%、77%、77%,氨基酸序列与毛果杨的COMT基因达100%。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明茶树COMT基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,电泳检测到一条大约60ku的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。

儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因多态性研究

为分析中国汉族人儿茶酚胺氧位甲基转移酶 (COMT)基因多态性 ,用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)技术分析了 53名正常中国汉族人COMT基因 1 94 7位点的多态性 ;并对NIaⅢ内切酶酶切后有异常带出现的标本PCR产物直接进行序列分析。发现中国汉族人COMT基因的A 1 94 7位点的频率为 0 .2 8;基因型G/G、G/A与A/A的频率分别为 0 .51 ,0 .4 2和 0 .0 7;并发现了C1 883/G和G1 966/T

社区健康老人儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因val158met多态性与综合认知训练效果的相关研究

目的探索儿茶酚胺氧位甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase,COMT)基因val158met多态性与社区健康老人综合认知训练效果的关系。方法对90名≥70岁的社区健康老人进行12周共24次的综合认知训练,干预前后采用中国老年成套神经心理测验(neuropsychological test battery for elderly,NTBE)评定认知功能,并通过TaqMan探针单核苷酸多态性基因分型技术检测COMT基因val158met多态性。结果基线时,COMT基因val158met多态性met等位基因携带组(n=38)组和未携带组(n=52)之间NTBE各项分测验成绩的差异均无统计学意义(P>0.05)。干预后,未携带met等位基因组NTBE 4项分测验成绩优于携带组(P<0.05);而与基线比较,未携带met等位基因组NTBE的成绩13项提高(P<0.05),1项下降(P<0.05);携带met等位基因组8项提高(P<0.05),3项下降(P<0.05)。结论 COMT基因val158met多态性与社区健康老人综合认知训练效果可能相关。

儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因Val158Met多态性与帕金森病抑郁的相关性

目的探讨儿茶酚胺氧位甲基转移酶(COMT)基因Val158Met多态性与中国帕金森病抑郁的相关性。方法 2016年6月至2017年12月,散发帕金森病患者268例,根据汉密尔顿抑郁量表评定结果分为抑郁组(n=116)和非抑郁组(n=152)。同时招募252例既往健康,无神经系统疾病,性别、年龄与患者相匹配的健康体检者作为对照组。两组留取外周血,提取基因组DNA。采用限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(PCR-RELP)和限制性酶切,分析COMT基因Val158Met多态性。结果抑郁组、非抑郁组、对照组在COMT基因Val158Met位点基因型(χ~2=0.78,P>0.05)、等位基因(χ~2=0.25,P>0.05)分布均无显著性差异。结论 COMT基因Val158Met多态性并非中国帕金森病抑郁人群的遗传易感因素。

攻击行为与儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因多态性研究

目的：探讨精神疾病伴发的攻击行为与儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-0-methyltransferase，COMT)基因多态性的关系。方法：研究组(有攻击行为)43例，疾病对照组41例。健康对照组156例。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-KFLP)技术分析COMT基岗多态性。结果：①研究组的COMT基因型与健康对照组之间的差异有统计学意义。②研究组与疾病对照组之间的差异无统计学意义。③等位基因A携带患者在疾病症状(敌对性、情感平淡)及认知功能方面存在差异。结论：精神疾病患者其COMT基因多态性及等位基因分布频率与健康对照者不同。等位基因A携带患者的症状表现不同。攻击行为与COMT基因多态性无相关性。

我国福建汉族人群儿茶酚氧位甲基转移酶基因多态性研究

目的:了解福建省汉族人儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)1947位点基因多态性分布,为探讨该基因多态性与疾病的相关性及对药物代谢影响提供遗传背景资料。方法:应用聚合酶链反应技术-限制性内切酶分析检测了166名福建汉族正常人的COMT基因1947位点多态性,并比较了不同人群之间的基因型与等位基因频率。结果:福建汉族人COMT1947位点基因型(GG,GA和AA)分布频率分别是58.4%,36.7%,4.8%。COMT1947位点等位基因频率G和A分别是77%和23%。福建汉族人COMT1947位点的基因型分布和等位基因频率同肯尼亚人、日本人、台湾地区汉族人群比较差异无显著性,与美国、英国、芬兰和东南亚人比较,差异有极显著性(P<0.01)。福建汉族人COMT的GG纯合型显著高于美国、英国、芬兰和东南亚人群;而AA纯合型显著低于美国、英国、芬兰和东南亚人群。结论:福建汉族人COMT1947位点基因多态性分布不同于某些地区的人群,具有种族差异。

正常中国汉人红细胞中儿茶酚氧位甲基转移酶的活性测定

目的 测定正常中国人群红细胞儿茶酚氧位甲基转移酶（COMT）活性浓度值，为研究COMT活性变化在疾病诊断中的应用提供依据。方法采用高效液相色谱法测定279名正常健康人（其中男性134例，女性145例）红细胞中COMT的活性浓度，用SPSS统计软件对性别间测定结果进行检验比较。结果男性和女性红细胞中COMT活性浓度分别为：（16．5±7．4）、（15．5±5．3）nmol·mL RBC^-1·h^-1。活性频率分布男性在6．0～37．4nmol·mL RBC^-1·h^-1，女性为5．4～37．2nmol·mL RBC^-1·h^-1，男女之间COMT活性浓度的差异无统计学意义（P〉0．05）。结论本法灵敏，简便，准确，重复性好，且测定结果与国外一些报道一致，适用于临床应用测定研究。本结果可作为中国健康人红细胞COMT活性正常值及今后研究的重要参考数据。