补阳还五汤类方对氧糖剥夺再复糖复氧海马神经元细胞的体外保护作用及其机制研究

目的探讨补阳还五汤类方(补阳还五汤、脑心通胶囊、养阴通脑颗粒)对乳鼠氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)海马神经元细胞的体外保护作用及其机制。方法原代培养海马神经元细胞,建立海马神经元OGD/R模型,CCK-8法确定补阳还五汤类方含药血清于海马神经元细胞的作用浓度。实验设对照组、模型组、补阳还五汤含药血清组(10%)、脑心通胶囊含药血清组(10%)、养阴通脑颗粒含药血清组(10%)、补阳还五汤含药血清+TAK-242组(10%,1μmol·L^-1)、脑心通胶囊含药血清+TAK-242组(10%,1μmol·L^-1)、养阴通脑颗粒含药血清+TAK-242组(10%,1μmol·L^-1)共8组。倒置相差显微镜下观察海马神经元生长形态,试剂盒检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)的含量,Hoechst 33358染色荧光显微镜观察神经元细胞的凋亡情况,蛋白免疫印迹(Western blot)检测TLR4/NF-κB信号通路上关键蛋白的表达情况。结果补阳还五汤类方均可以降低海马神经元细胞TNF-α和IL-1β的释放量,显著降低细胞凋亡数,抑制TLR4/NF-κB信号通路中TLR4和NF-κB蛋白的表达,对OGD/R海马神经元细胞的炎症反应起到了保护作用。TLR4特异性抑制剂TAK-242的加入,阻断了该信号通路的传导,降低了补阳还五汤类方的保护作用。结论补阳还五汤类方对OGD/R致海马神经元细胞发生的炎症反应具有保护作用,其作用机制可能与TLR4/NF-κB信号通路有关,且脑心通胶囊的抗炎保护作用相对明显。

PC12细胞氧糖剥夺模型细胞自噬与损伤的关系及黄芪甲苷的保护作用研究

目的：研究PC12细胞OGD/R后自噬与损伤的经时性变化以及黄芪甲苷的干预效应。方法：探讨PC12细胞OGD/R后不同时间自噬的变化及与细胞损伤的关系,初步确定细胞发生自噬性损伤的时间点,再制作PC12细胞OGD/R自噬性损伤模型,研究黄芪甲苷抗自噬性损伤的作用。结果：复糖复氧6~36 h后,细胞存活率降低、LDH漏出率增加;用3-MA预处理后,可使复糖复氧6~12 h细胞存活率降低、LDH漏出率增加,复糖复氧后24~36 h相反。激光共聚焦和western-blot检测显示,复糖复氧后6 h LC3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加,至24 h达高峰;p62蛋白表达随再复糖复氧时间的延长逐渐降低。黄芪甲苷对OGD 2 h复糖复氧24 h的PC12细胞自噬具有显著抑制作用,且呈剂量依赖性。结论：PC12在在OGD复糖复氧6~12 h,自噬减轻神经细胞的损伤,而在24~36 h后加重细胞损伤;黄芪甲苷可通过抑制细胞过度自噬诱导的细胞损伤,从而发挥对受损细胞的神经保护作用。

人参皂苷Rg1抗PC12细胞氧糖剥夺复糖复氧后损伤与自噬关系的研究

目的:探讨人参皂苷Rg1(Rg1)对PC12细胞氧糖剥夺后再复糖复氧(OGD/R)诱导的细胞自噬性损伤的作用及作用机制。方法:以PC12细胞建立OGD/R自噬性损伤模型,观察Rg1抗OGD/R后细胞自噬性损伤的作用,并从PI3KⅠ/Akt/m-TOR和PI3KⅢ/Becline-1/Bcl-2信号通路研究其作用机制。结果:Rg1能增加OGD/R诱导的PC12细胞存活、减少乳酸脱氢酶(LDH)漏出;同时抑制细胞自噬体的形成,降低胞浆LC3-Ⅱ阳性斑片的数量、下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值而上调p62蛋白表达。机制研究结果表明,Rg1提高了PI3KⅠ、Akt、m-TOR蛋白磷酸化水平,对PI3KⅢ、Becline-1和Bcl-2蛋白表达没有影响。结论:在缺糖缺氧2h再复糖复氧24h,细胞出现过度自噬和损伤,Rg1均能减轻OGD/R诱导的PC12细胞自噬性损伤,其机制可能与激活PI3KⅠ/Akt/m-TOR信号通路有关。

富氢水通过降低小鼠神经细胞OGD/R后过度自噬减轻细胞损伤

目的探讨富氢水是否通过影响小鼠海马神经元细胞株(HT22细胞)氧糖剥夺/复氧(OGD/R)后自噬水平而发挥细胞损伤的保护作用。方法取体外培养的对数增长期小鼠HT22细胞,用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞活性,寻找Na_(2)S_(2)O_(4)的最佳制模浓度。将HT22细胞分为对照组(NC组)、OGD/R组(无糖培养基+10 mmol/L Na_(2)S_(2)O_(4)处理90 min后换正常培养基继续培养4 h)和富氢水处理组(HW组,无糖培养基+10 mmol/L Na_(2)S_(2)O_(4)处理90 min后换含富氢水培养基继续培养4 h)。采用倒置显微镜观察HT22细胞形态;CCK-8法检测细胞活性;透射电镜观察细胞超微结构;免疫荧光法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1的表达;蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测细胞自噬标志物LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的蛋白表达。结果倒置显微镜下显示:与NC组比较,OGD/R组细胞状态差,胞体肿胀,可见细胞裂解碎片,细胞活性明显降低〔(49.1±2.7)%比(100.0±9.7)%,P<0.01〕;与OGD/R组比较,HW组细胞状态改善,细胞活性明显升高〔(63.3±1.8)%比(49.1±2.7)%,P<0.01〕。透射电镜下显示:与NC组比较,OGD/R组细胞神经元核膜溶解,可见较多数量自噬溶酶体;与OGD/R组比较,HW组细胞神经元损伤减轻,自噬溶酶体数量明显减少。免疫荧光法检测结果显示:与NC组比较,OGD/R组细胞LC3和Beclin-1的表达明显增强;与OGD/R组比较,HW组LC3和Beclin-1的表达明显减弱。Western blotting检测结果显示:与NC组比较,OGD/R组细胞LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的蛋白表达均明显升高(LC3Ⅱ/Ⅰ:1.44±0.05比0.37±0.03,Beclin-1/β-actin:1.00±0.02比0.64±0.01,均P<0.01);与OGD/R组比较,HW组细胞LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的蛋白表达均明显降低(LC3Ⅱ/Ⅰ:0.54±0.02比1.44±0.05,Beclin-1/β-actin:0.83±0.07比1.00±0.02,均P<0.01)。结论富氢水对OGD/R致HT22细胞损伤有明显的保护作用,其机制可能与抑制自噬相关。