结合珠蛋白和血红蛋白对氧葡萄糖剥夺-再恢复小鼠小胶质细胞的影响

目的探讨结合珠蛋白(Hp)和血红蛋白(Hb)影响氧葡萄糖剥夺-再恢复(OGDR)小鼠小胶质细胞BV2的细胞存活率、极化及炎症反应。方法采用BV2细胞构建OGDR细胞模型。OGDR同时加入Hb和(或)Hp进行干预,分为OGDR组(OGDR损伤)、5、10、15、20μmol/L Hb组(OGDR损伤+5、10、15μmol/L Hb)、HP组(OGDR损伤+4μmol/L HP)、Hb+HP组(OGDR损伤+15μmol/L Hb+4μmol/L Hp)和对照组(细胞常规培养)组。采用细胞计数试剂盒(CCK)8法检测细胞存活率变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液中白细胞介素(IL)-6、IL-10和肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测极化特异性标记几丁质酶样蛋白(CHIL)3、CD206、精氨酸酶(Arg)-1、一氧化氮合酶(iNOS)、CD163、CD11b和CD32的mRNA表达,Western印迹检测细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)4蛋白表达。结果常规培养条件下,BV2细胞给予不同浓度的Hb、Hp及Hb+Hp进行干预,各组细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)。OGDR干预BV2细胞的同时加入不同浓度Hb和(或)4μmol/L Hp进行干预,与OGDR组相比,15、20μmol/L Hb组细胞存活率明显下降(P<0.05);与15μmol/L Hb组相比,Hb+Hp组细胞存活率明显下降(P<0.05)。与对照组、OGDR组和15μmol/L Hb组相比,Hb+Hp组IL-6及TNF-α水平明显升高(P<0.05);4组IL-10水平差异无统计学意义(P>0.05)。对照组、OGDR组、15μmol/L Hb组和Hb+Hp组蛋白CHIL3、Arg-1、CD163和CD11b mRNA表达差异无统计学意义(均P>0.05);CD206、iNOS和CD32 mRNA表达差异有统计学意义(均P<0.05)。与对照组、OGDR组15μmol/L Hb组对比,Hb+Hp组GPX4蛋白表达量明显降低(P<0.05)。结论Hp和Hb加重了OGDR的BV2细胞的细胞损伤,并促进其向促炎方向激活。

TRAF5通过调控IL-17A/NF-κB信号通路减轻氧-糖剥夺/再灌注引起的心肌细胞炎症和细胞凋亡

目的 探讨肿瘤坏死因子受体相关因子5(tumor necrosis factor receptor-associated factor 5,TRAF5)对氧-葡萄糖剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)引起的心肌细胞炎症和细胞凋亡的影响及相关分子机制。方法 体外培养大鼠心肌细胞系H9c2细胞,构建OGD/R诱导的H9c2细胞模型,以脂质体转染法将TRAF5过表达质粒(pcDNA-TRAF5)和空载质粒(pcDNA-NC)转染至OGD/R诱导的H9c2细胞。采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测细胞中TRAF5基因表达,CCK-8法测定细胞活力,试剂盒法检测细胞中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)和炎性因子水平,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中相关蛋白表达。结果 与对照组比较,OGD/R组H9c2细胞中TRAF5 mRNA和蛋白表达量降低,细胞活力降低,细胞中LDH、cTnT、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)浓度升高,细胞凋亡率升高,细胞中B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表达量降低,Bcl-2相关蛋白(B-cell-lymphoma-2 related protein,Bax)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteine aspartate proteolytic enzyme-3,cleaved caspase-3)、白细胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)蛋白表达量及磷酸化核转录因子-κB(phosphorylated nuclear factor-κB,p-NF-κB)/NF-κB比值升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与OGD/R组比较,OGD/R+pcDNA-TRAF5组H9c2细胞中TRAF5 mRNA和蛋白表达量升高,细胞活力升高,细胞中LDH、c TnT、TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1浓度降低,细胞凋亡率降低,细胞中Bcl-2蛋白表达量升高,Bax、cleaved caspase-3、IL-17A蛋白表达量及p-NF-κB/NF-κB比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TRAF5可减轻OGD/R引起的心肌细胞炎症和细胞凋亡,其作用机制可能与调控IL-17A/NF-κB信号通路有关。

氧葡萄糖剥夺-再恢复后抑制小胶质细胞TLR9激活对神经元的保护作用

目的:观察氧葡萄糖剥夺-再恢复(OGDR)后小胶质细胞BV-2 Toll样受体9(TLR9)激活对神经元凋亡的影响。方法:对BV-2细胞或TLR9-siRNA转染的BV-2细胞进行OGDR处理4 h后,将细胞上清添加至OGDR处理4 h的小鼠原代皮层神经元中,继续正常培养24 h后,倒置显微镜下观察神经元形态变化,TUNEL染色检测神经元凋亡,Western blotting检测神经元caspase-3蛋白的表达。实验分为正常BV-2组、negative control-siRNA组、TLR9-siRNA组、OGDR组、OGDR+NC-siRNA组、OGDR+TLR9-siRNA组和对照组(神经元OGDR后不添加BV-2细胞上清)。结果:OGDR后神经元胞体肿胀,折光性下降,出现空泡样变,轴突变细、扭曲、断裂。TUNEL染色各组均可见绿染凋亡小体。与对照组比较,其它组的caspase-3蛋白表达升高(P<0.05);与正常BV-2组比较,OGDR组和TLR9-siRNA组的caspase-3蛋白表达升高(P<0.05);OGDR+TLR9-siRNA转染组与TLR9-siRNA转染组和OGDR组比较,caspase-3蛋白表达下降(P<0.05)。结论:OGDR后BV-2细胞TLR9激活致神经元凋亡增多,caspase-3蛋白表达升高;抑制TLR9表达后,神经元损伤减轻。

微小RNA-199a-5p调控Klotho表达对体外脑缺血再灌注大鼠氧-葡萄糖剥夺/再灌注诱导的肾上腺嗜铬瘤细胞损伤的保护作用

目的探究抑制微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)表达对体外脑缺血再灌注(I/R)损伤大鼠模型氧-葡萄糖剥夺/再灌注(OGD/R)诱导的肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)损伤的保护作用,并进一步探讨Klotho在该过程中的作用。方法将PC12细胞分为Control组、OGD/R组、miR-NC inhibitor组、miR-199a-5p inhibitor组、miR-199a-5p inhibitor+shRNA-pLKO.1组和miR-199a-5p inhibitor+shRNA-Klotho组。RT-qPCR或蛋白质印迹法(Western blotting)确定各组PC12细胞转染效率;胆囊收缩素/缩胆囊素八肽(CCK-8)和流式细胞术确定各组PC12细胞活力和凋亡率;试剂盒测量各组PC12细胞中活性氧(ROS)释放量、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组PC12细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-6(IL-6)水平;双荧光素酶报告基因实验检测miR-199a-5p与Klotho靶向关系。结果在OGD/R诱导的PC12细胞中,miR-199a-5p表达增高,Klotho表达降低;细胞活力降低,凋亡率增高;ROS释放量和MDA含量以及TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平升高,SOD和GSH-Px活性降低(P<0.05)。转染miR-199a-5p抑制物减弱了OGD/R的诱导PC12细胞活力下降和细胞凋亡率增高;削弱了暴露于OGD/R的PC12细胞中ROS释放量和MDA含量以及TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-6水平,并提高了SOD与GSH-Px活性(P<0.05),而miR-199a-5p抑制物对OGD/R诱导PC12细胞的这些作用可被敲低的Klotho逆转(P<0.05)。另外,miR-199a-5p负靶向调控Klotho表达(P<0.05)。结论抑制miR-199a-5p通过靶向Klotho减轻氧化应激和炎症反应来改善OGD/R诱导的PC12细胞损伤。

银胶菊内酯减轻氧糖剥夺/再灌注诱导的PC12细胞损伤

目的探讨银胶菊内酯(PTN)对脑缺血/再灌注(I/R)损伤的神经保护作用及可能机制。方法将培养的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞分为对照组、氧-糖剥夺-再灌注(OGD/R)组及PTN预处理组(1、5、10和20μmol/L,各组n=3)。CCK-8法检测细胞活力;酶活性检测试剂盒检测caspase-3、过氧化氢(H2O2)酶、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性及乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS);Western blot检测Bcl-2、Bax、p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表达。结果与对照组相比,OGD/R组PC12细胞活力、LDH和ROS含量、Bcl-2表达水平、Akt和GSK-3β的磷酸化水平及H2O2酶、SOD和GPx的活性均明显下降(P<0.05);ROS含量、Bax-1表达量和caspase-3活性均明显升高(P<0.05);与OGD/R组相比,PTN预处理能显著缓解以上变化(P<0.05)。结论 PTN可以作为一种潜在的治疗脑I/R损伤的药物。

基于Sirt1/NF-κB信号通路探讨红景天苷在脑缺血再灌注体外模型中的神经保护作用

目的 研究红景天苷通过沉默信息调节因子(Sirt)1/核因子(NF)-κB信号通路对氧葡萄糖剥夺/再恢复(OGD/R)损伤的人神经母细胞瘤细胞的保护作用。方法 取人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞随机分为正常组(常规培养)、模型组(OGD/R处理)、实验组1(10μmol/L红景天苷+OGD/R)、实验组2(20μmol/L红景天苷+OGD/R)、NF-κB信号通路激活剂(SC7273)+实验组2(1μg/ml SC7273+20μmol/L红景天苷+OGD/R)。噻唑蓝(MTT)法测量细胞存活率;微量酶标法检测细胞中乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,流式细胞术测定细胞凋亡率;Western印迹检测Sirt1、NF-κB及NF-κB p65蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组SH-SY5Y细胞存活率、Sirt1蛋白表达显著降低,LDH漏出率、凋亡率、NF-κB及NF-κB p65蛋白表达显著上升(均P<0.05);与模型组比较,实验组1、实验组2细胞存活率、Sirt1蛋白表达显著升高,LDH漏出率、凋亡率、NF-κB及NF-κB p65蛋白表达显著下降(均P<0.05);与实验组2比较,SC7273+实验组2细胞存活率及Sirt1蛋白表达显著降低,而LDH漏出率、凋亡率、NF-κB及NF-κB p65蛋白表达显著升高(均P<0.05)。结论 红景天苷通过调控Sirt1/NF-κB信号通路,减轻OGDR诱导的SH-SY5Y细胞损伤。

星形胶质细胞连接蛋白43及其半通道在脑缺血再灌注损伤中的作用

目的探讨星形胶质细胞连接蛋白43(Cx43)及其半通道在缺血再灌注(IR)损伤中的作用。方法 32只Wistar鼠被随机分为IR 0 h组、IR 4 h组和IR 24 h组和对照组,每组8只鼠。用免疫组化和Western印迹法检测各组大鼠星形胶质细胞Cx43、半通道抗体1(HC1)和半胱天冬酶3(Casp3)的表达。在氧葡萄糖剥夺-再恢复(OGDR)0 h,4 h和24 h,用MTT法检测星形胶质细胞活性,用免疫组化和Western印迹法检测Cx43,HC1和Casp3表达的改变。结果大鼠星形胶质细胞中HC1的表达明显少于Cx43的表达。与对照组比较,IR 4 h组大鼠脑组织中Cx43、HC1和Casp3的表达明显增加(均P<0.05),而IR 0 h组和IR 24 h组却没有明显的变化。OGDR后星形胶质细胞cell line和Psup细胞中Cx43、HC1和Casp3的表达在OGDR 4h组明显高于对照组(均P<0.05),在OGDR 24 h组则与对照组差异无统计学意义。OGDR后shRNA星形胶质细胞中Cx43、HC1和Casp3的表达无统计学意义上变化。结论 Cx43及HCl在星形胶质细胞凋亡过程中起到了促进作用,这可能是IR损伤发生及发展的机制之一。

玄参环烯醚萜苷对氧糖剥夺再灌注诱导的原代皮层神经元细胞内质网应激的作用研究

目的探讨玄参环烯醚萜苷通过内质网应激介导的细胞凋亡通路对氧糖剥夺再灌注(OGD/R)诱导的原代皮层神经元细胞的作用及机制。方法分离SD大鼠原代皮层神经元,用玄参环烯醚萜苷(50、100、200 μg/mL)对原代皮层神经元进行预处理24 h,采用OGD/R诱导制备脑缺血再灌注细胞模型,倒置显微镜下鉴定细胞纯度,观察细胞形态变化;MTT法检测细胞存活率;试剂盒检测细胞内乳酸脱氢酶(LDH)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blotting法检测C/EBP同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白-78(GRP78)和Caspase-12蛋白表达。结果培养的原代皮层神经元胞体饱满,状态良好,纯度较高。与对照组比较,经OGD/R处理后原代皮层神经元整体回缩变圆,胞体表面变粗糙;细胞存活率、SOD活性显著降低;LDH水平、细胞凋亡率显著升高;CHOP、Caspase-12和GRP78蛋白表达水平显著升高。与模型组比较,玄参环烯醚萜苷预处理能改善细胞损伤情况;提高细胞存活率、SOD活性;降低LDH水平和细胞凋亡率;降低CHOP、Caspase-12和GRP78蛋白表达水平。结论玄参环烯醚萜苷能拮抗OGD/R诱导的原代皮层神经元神经损伤,其作用机制与抑制内质网应激介导的细胞凋亡有关。