氧诱导新生小鼠视网膜病变中血管新生和氧应激相关基因表达的变化

目的建立氧诱导新生小鼠视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型,观察视网膜血管新生情况,检测OIR病变过程中调控血管新生和氧应激相关基因表达的变化。方法新生小鼠出生后d 7,置75.5%高氧环境中饲养5 d,再返回正常氧环境继续饲养5 d,建立OIR模型。运用视网膜免疫荧光染色检测OIR小鼠视网膜中血管新生情况;运用Real-time PCR技术检测基因表达情况。结果视网膜免疫荧光染色结果显示,OIR小鼠视网膜在高氧诱导视网膜微血管消退的基础上,相对缺氧状态诱导出现明显的新生血管。Real-time PCR结果显示OIR模型小鼠视网膜中:血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(VEGFR)家族中:VEGFA、VEGFD、VEGFR1、VEGFR2的基因表达分别上调1.73、1.71、1.48、1.80倍;血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)及其受体(PDGFR)家族中:PDGFA、PDGFB、PDGFRa、PDGFRb的基因表达分别上调1.29、1.71、1.42、1.42倍;基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)中的MMP2基因表达上调1.48倍;参与调控氧化应激的核转录因子Nrf2[nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2]及受其调控的下游基因包括谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamatecysteine ligase,GCL)的催化(GCLC)和调节(GCLM)亚单位的基因表达均下调,表达量分别为正常的0.28、0.76、0.49。结论 OIR小鼠视网膜病变过程中,视网膜中促进血管新生相关基因表达上调,而抗氧化相关基因表达下调。

三七总皂苷对氧诱导新生小鼠视网膜病变新生血管的作用研究

目的主要分析三七总皂苷对氧诱导新生小鼠视网膜病变新生血管的作用。方法选取新生小鼠60只,将其分为A组、B组,其中A组小鼠24只,为正常环境下饲养的小鼠,B组为氧诱导视网膜病变组,其中B组小鼠接受三七总皂苷治疗,评价三七总皂苷对氧诱导新生小鼠视网膜病变新生血管的影响。结果统计两组小鼠的视网膜内界膜血管内皮细胞核计数情况,B组小鼠治疗前后数据差异显著,与A组小鼠相比,数据差异无统计学意义(P>0.05)。结论三七总皂苷对氧诱导新生小鼠视网膜病变新生血管中的作用显著,证明该物质对视网膜新生血管的形成具有影响。

基于基因共表达网络分析氧诱导小鼠视网膜新生血管模型免疫相关靶基因

目的:通过生物信息学方法探究氧诱导小鼠视网膜新生血管(OIR)模型中与免疫相关的关键基因以及免疫细胞浸润水平。方法:从GEO数据库获取基因芯片数据集,采用R语言环境中“limma”包获得差异表达基因(DEGs),并进行GO功能富集和KEGG通路分析,基于CIBERSORT算法进行数据集免疫细胞浸润分析,通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选与免疫相关基因模块中的DEGs,利用STRING在线数据库及Cytoscape软件构建蛋白质互作(PPI)网络,利用cytoHubba模块筛选出最终的靶基因。结果:筛选出467个表达具有显著差异性的基因,其中270个基因表达上调,197个基因表达下调。免疫浸润分析结果显示仅辅助型T细胞2(Th2 cells)高表达,且差异具有显著性(P<0.05)。WGCNA分析后,与免疫最相关模块中差异基因为66个,构建PPI网络后利用插件筛选出5个关键基因,即血管性血友病因子(vWF)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、Serping1、凋亡诱导因子1(AIF1)以及信号传导蛋白和转录激活物(STAT3)。结论:采用生物信息学的方式进行OIR模型的免疫细胞浸润分析及筛选出与免疫相关的关键基因,可为视网膜新生血管性疾病的进一步研究与诊疗提供依据。

氧诱导视网膜病变模型小鼠肾组织代谢组学研究

目的探讨高氧环境对氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠肾脏代谢物的影响,了解病理性视网膜血管新生和肾损伤之间的潜在机制。方法采用随机数字表法将16只健康SPF级C57/B6J新生小鼠随机分为OIR组与正常对照组,每组8只。小鼠自出生后标准饲养至第7天(P7),OIR组小鼠和母鼠置于(75±2)%的高氧箱中饲养至P12,然后正常饲养;正常对照组一直在正常环境下饲养。各组小鼠在饲养P17时采用二氧化碳安乐死,取视网膜组织铺片并行血管异凝集素(IB4)染色,观察视网膜血管形态、中央无灌注区及病理性新生血管情况;另取小鼠肾组织进行液相色谱-质谱分析,取其对应小鼠的全血进行抗凝处理,通过离心沉淀,获得不含细胞成分的血浆,对血浆进行靶向代谢组学分析。使用代谢组学数据处理软件Progenesis QI v2.3对质谱信息进行解析,用无监督的主成分分析及正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)来区分各组间代谢轮廓的总体差异,比较2个组间代谢物的倍数变化。以变量权重值>1且P<0.05为条件筛选出差异代谢物。基于KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路富集分析。结果视网膜铺片IB4染色结果显示,P17时正常对照组小鼠视网膜血管分布均匀;OIR组小鼠视网膜周边血管迂曲、紊乱,中央可见大面积无灌注区域形成,在视网膜无灌注区和血管区交界处形成大量新生血管簇,呈强荧光染色。OIR组小鼠视网膜无灌注区相对面积为(25.16±3.50)%,明显大于正常对照组的(0.63±0.30)%,差异有统计学意义(t=12.07,P<0.001)。OPLS-DA模型参数R2X cum、解释率R2Y cum、和预测率Q2 cum分别为0.578、0.978和0.857,表明OPLS-DA模型具有较好的预测能力。共筛选鉴定到26个主要的差异代谢物,其中上调表达17个,下调表达9个,包括甘油磷脂类化合物[PC 20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0∶0、PC 22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0∶0、PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)、PE P-18∶0/20∶4(6E,8Z,11Z,14Z)(5OH[S])]、氨基酸类代谢物(精氨酸、鸟氨酸、哌可酸和羟基赖氨酸)、嘌呤类(鸟嘌呤、次黄嘌呤、羟嘌醇)和脂肪酸类(15-棕榈酸甲酯、2,6,8,12-Tetramethyl-2,4-tridecadien-1-ol)等。差异代谢物主要富集于ABC转运蛋白(L-精氨酸、牛磺酸、肌醇、腺苷、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖、L-谷氨酰胺)、氨酰-tRNA生物合成(L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酰胺)、精氨酸生物合成(L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-谷氨酰胺)等代谢通路。血浆的靶向代谢组学结果显示,差异的氨基酸类代谢产物主要富集于氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成代谢以及ABC转运蛋白等代谢通路。结论OIR小鼠的ABC转运蛋白、氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成代谢通路可能参与了肾损伤及早产儿视网膜病变新生血管形成的病理变化过程。

芪灯明目胶囊对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜血管的保护作用

目的研究芪灯明目胶囊对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管形成及重塑的影响。方法将36只出生后第7天的(P7)SPF级C57BL/6J幼鼠采用随机数字表法分为正常组、OIR组、芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组,每组9只。正常组小鼠于正常环境下饲养,其余小鼠均在高氧环境中[氧浓度为(75±2)%]饲养5 d(P7~P12)后再在正常环境中饲养5 d(P12~P17)建立OIR模型。芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组从P12开始分别给予芪灯明目胶囊(900 mg/kg)与血管内皮生长因子受体2抑制剂阿帕替尼(70 mg/kg)灌胃,1次/d,连续5 d。P17时,摘取小鼠眼球,制作眼球石蜡切片并行苏木精-伊红染色,计数各组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞数目;制作视网膜铺片并行FITC-dextran荧光染色,计算视网膜无灌注区面积比、新生血管密度与总血管密度;采用免疫荧光染色法检测视网膜血管内皮细胞标志物CD31与周细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的分布和荧光强度;采用免疫组织化学染色法检测视网膜缺氧诱导因子1α(HIF-1α)与血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)的表达分布。结果正常组、OIR组、芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组突破内界膜的血管内皮细胞数目分别为(2.83±4.40)、(37.33±5.43)、(23.83±6.79)和(14.00±9.34)个,总体比较差异有统计学意义(F=28.313,P<0.001),其中OIR组突破内界膜血管内皮细胞数明显多于正常组、芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。视网膜铺片结果显示,OIR组视网膜存在大片无灌注区域与新生血管芽,血管迂曲,分布紊乱,芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组血管分布较OIR组更均匀,无灌注区面积和新生血管较OIR组减少。正常组、芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组视网膜无灌注区面积比和新生血管密度均较OIR组降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常组、芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组CD31免疫荧光强度和HIF-1α吸光度值明显低于OIR组,α-SMA免疫荧光强度和VE-cadherin吸光度值明显高于OIR组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论芪灯明目胶囊能够抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成,增加血管周细胞覆盖,缓解视网膜缺氧以及增加血管完整性,对OIR小鼠视网膜血管起到保护作用。

Apelin及其受体和一氧化氮合酶在氧诱导的新生小鼠增生性视网膜病变中表达上调

目的:通过观察apelin及其受体APJ和一氧化氮合酶(NOS)在氧诱导的新生小鼠增生性视网膜病变中的表达,探讨apelin/APJ和一氧化氮(NO)是否参与了早产儿视网膜病变新生血管的发生。方法:36只7日龄C57BL/6J新生小鼠随机均分为高氧组和对照组。高氧组暴露在75%±2%的氧浓度下5 d后,在正常空气环境下饲养5 d;对照组小鼠在正常氧环境下饲养10 d。两组均在17日龄处死,取左眼眼球做石蜡切片,HE染色计数突破内界膜的血管内皮细胞核数,以判断造模是否成功。实时荧光定量PCR检测右眼视网膜组织apelin和APJmRNA的表达,免疫荧光组织化学法检测视网膜apelin、APJ、eNOS和iNOS蛋白的表达。结果:高氧组视网膜平均每个切面突破内界膜的血管内皮细胞核数(35.13±10.13)明显高于对照组(0.30±0.21,P<0.01),说明造模成功。高氧组apelin和APJ mRNA水平显著高于对照组,分别为对照组的32.2倍和17.6倍(均P<0.01)。组织免疫荧光结果显示高氧组apelin和APJ蛋白表达明显强于对照组,并且主要强表达于新生血管周围;高氧组eNOS和iNOS蛋白表达明显强于对照组,但主要强表达于新生血管下方视网膜组织,在突破内界膜的血管内皮细胞核周围未见表达明显增强。结论:Apelin/APJ及NOS可能与氧诱导的新生小鼠增生性视网膜病变新生血管的发生有关。

Avastin玻璃体腔注射对小鼠氧诱导视网膜病变新生血管的抑制作用

背景早产儿视网膜病变（ROP）主要源于视网膜新生血管的形成，avastin可以同血管内皮生长因子（VEGF）的所有异构体发生高亲和力结合，拮抗其生理活性。目的观察玻璃体腔注射avastin对氧诱导视网膜病变模型新生血管的作用。方法取7日龄清洁级C57BL／6J小鼠90只，用随机数字表法随机分为6组：空气对照组、高氧对照组、高氧BSS组和低、中、高剂量avastin组，每组15只。空气对照组小鼠在空气中喂养，其他各组均置于体积分数75％±2％O，的高氧环境中饲养，连续5d，高氧BSS组大鼠玻璃体腔注射无菌BSS液0．5μl，3个avastin处理组小鼠分别玻璃体腔注射1．25、2．50、5．00g／Lavastin各0．5μl。17日龄时过量麻醉处死小鼠，摘除眼球制备视网膜组织切片，苏木精一伊红染色后计数突破内界膜的新生血管内皮细胞核数目；应用免疫组织化学染色法检测视网膜中CD34分子的表达；利用视网膜铺片技术观察低、中、高剂量avastin组大鼠视网膜新生血管的形态并进行比较。结果苏木精一伊红染色发现，高氧对照组小鼠视网膜突破内界膜的新生血管内皮细胞核数目明显多于空气对照组，差异有统计学意义（P〈0．01）；不同剂量的avastin组小鼠视网膜中突破内界膜的新生血管内皮细胞核数明显少于高氧BSS组和高氧对照组，差异均有统计学意义（P〈0．01）；高剂量avastin组与低剂量avastin组比较，突破内界膜的新生血管内皮细胞核数明显减少，差异有统计学意义（P〈0．05）。免疫组织化学检测显示，高氧对照组视网膜突破内界膜的内皮细胞CD34分子呈阳性表达。视网膜铺片可见空气对照组的血管自视盘向四周均匀放射，分支良好，结构清晰；高氧对照组、高氧BBS组可见大量新生血管，其结构紊乱，分布不均；各剂量avastin组随着剂量的增加，视网膜血管分布和走行接近空气对照组。结论玻璃体腔注射avastin可抑制视网膜新生血管的产生，其作用与avastin的剂量有关。

单核细胞趋化蛋白-1在氧诱导视网膜病变新生小鼠模型中的表达

背景单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是趋化因子家族中的主要成员之一，在肿瘤、炎症和糖尿病视网膜病变（DR）等新生血管性疾病中起着重要的作用，但关于MCP-1在氧诱导视网膜病变（OIR）发生过程中的表达及其作用的研究鲜有报道。目的观察OIR小鼠视网膜中MCP-1的表达，探讨MCP-1在视网膜血管发育和视网膜新生血管形成过程中的作用。方法SPF级C57BL／6J小鼠120只，按随机数字表法随机分为OIR组和正常对照组，每组60只。OIR组将出生后7d的新生小鼠在体积分数75％氧环境下饲养5d，然后返回正常大气环境中；正常对照组小鼠始终置于正常大气环境中饲养。OIR组和正常对照组分别在出生后5、7、12、14、17、21d随机抽取10只小鼠，摘除右眼球，采用免疫组织化学法检测MCP-1蛋白在小鼠视网膜中的表达情况，采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测MCP-1mRNA在小鼠视网膜中的表达。结果正常对照组小鼠在出生后的第5天即有MCP-1在视网膜的内核层和节细胞层表达，12d时表达MCP-1的阳性细胞数达到高峰，其他日龄时呈基线表达。OIR组12d时表达MCP-1的阳性细胞数轻度增多，14d时阳性细胞数显著增多，之后迅速下降至正常水平。正常对照组在5d时可检测到MCP-1mRNA表达，12d时显著上调，之后随小鼠日龄的增加，MCP-1mRNA表达迅速下降，14、17、21d表达基本呈基线水平。OIR组12d时，MCP-1mRNA较正常对照组下降，在新生血管形成关键期，即14d时表达显著上调，之后迅速下降至正常水平。OIR组和正常对照组间比较采用完全随机分组的两因素方差分析，F分组=5．230，P=0．028；F日龄6．898，P=0．001。结论小鼠视网膜发育过程始终伴随着MCP-1的表达，MCP-1的表达上调可能与小鼠视网膜血管发育和OIR模型中视网膜新生血管的形成密切相关。

氧诱导视网膜病变小鼠模型新生血管变化规律及VEGF的动态表达

目的观察氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy,OIR)小鼠模型新生血管变化规律及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的动态表达,利用VEGF的变化反映OIR模型视网膜组织中新生血管的发生发展。方法80只C57BL/6J新生幼鼠随机分为OIR组和对照组,每组各40只。OIR组7d龄鼠暴露在(75±2)%浓度的高氧状态下5d,随后在正常空气环境下饲养;对照组小鼠,均在正常空气环境下饲养。2组均于12d龄(P12)、14d龄(P14)、17d龄(P17)、21d龄(P21)随机抽取2组小鼠各10只(20眼)处死,利用视网膜组织切片,HE染色计数突破视网膜内界膜的内皮细胞核数,分析视网膜新生血管增生情况;实时荧光定量RT-PCR(real time RT-PCR)观察VEGF mRNA的动态表达规律。结果突破视网膜内界膜的内皮细胞核数显示对照组小鼠视网膜新生血管P12、P14、P17、P21分别为0.27±0.12、0.30±0.15、0.31±0.13、0.40±0.17,自始至终很少见到突破内界膜的内皮细胞核;OIR组小鼠视网膜新生血管P12、P14、P17、P21分别为0.41±0.16、10.25±2.68、34.14±1.79、8.12±2.13,P17达高峰,以后逐渐下降。real time RT-PCR显示对照组视网膜病变中VEGF mRNAP12、P14、P17、P21分别为9.29±0.13、9.52±0.17、10.49±0.24、10.51±0.29;P12时表达相对较高,以后逐渐下降。OIR组视网膜病变中VEGF mRNAP12、P14、P17、P21分别为10.45±0.11、7.41±0.48、8.53±0.32、10.56±0.17;P12表达较低,P14达高峰,以后逐渐下降。2组VEGF mRNA P12、P14、P17时表达差异均有统计学意义(均为P<0.05),在P21时表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论VEGF是重要的血管生成因子,利用VEGF mRNA的动态表达可以映射视网膜新生血管的发生发展过程,为进一步研究奠定基础。

EPO加重氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的形成

目的：探讨外源性人重组促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin,rh EPO）对氧诱导视网膜病变（oxygen-induced retinopathy,OIR）小鼠模型视网膜新生血管形成的影响及其可能的作用机制。方法：将132只7日龄C57BL/6J鼠随机均分成6组：正常对照组、OIR组、OIR＋0.9%氯化钠溶液组、OIR＋rh EPO 10 IU组、OIR＋rh EPO 50 IU组、OIR＋rh EPO 100 IU组。除正常对照组外,其他5组采用将7日龄鼠在（75±2）%的高氧环境中饲养5 d,随后转至正常空气中再饲养5 d的方法建立OIR模型。3~6组分别进行0.9%氯化钠溶液和rh EPO（10、50、100 IU）腹腔内注射,自生后7 d开始每日注射一次,共5 d。视网膜铺片免疫荧光法和HE染色法观察视网膜新生血管情况;Real-Time PCR和Western blot法检测视网膜组织中VEGF、e NOS、n NOS mRNA和蛋白质表达情况。结果：除正常对照组外其他组视网膜中均有大量新生血管生成,并可见血管的扩张、扭曲、闭塞;rh EPO治疗组中新生血管进一步增多,血管扩张更加显著。rh EPO的治疗加重了视网膜新生血管形成,并使视网膜组织中VEGF、e NOS、n NOS mRNA和蛋白质表达水平明显上调,呈剂量依赖性。结论：外源性rh EPO加重了OIR小鼠模型视网膜新生血管的形成,并使视网膜组织VEGF、e NOS和n NOS表达增加。

玻璃体内注射索拉非尼对大鼠氧诱导视网膜病变模型新生血管的作用

目的探讨玻璃体内注射索拉非尼对氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)大鼠模型视网膜新生血管的作用。方法 7 d龄SD乳鼠144只,随机分为6组:A组:对照组;B组:ROP组;C组:ROP溶媒对照组;D组:ROP+5μg索拉非尼组;E组:ROP+20μg索拉非尼组;F组:ROP+80μg索拉非尼组。除A组在正常氧环境下饲养外,其余各组乳鼠均建立OIR模型。乳鼠于生后第12天出氧箱后给予玻璃体内注射DMSO及相应剂量的索拉非尼,于生后第17天处死,做视网膜铺片,并于激光共聚焦显微镜下观察视网膜血管形态并在高倍视野下计数血管分支点数目;组织切片HE染色观察视网膜组织形态并计数突破内界膜的血管内皮细胞核数。结果视网膜铺片显示,B组和C组视网膜血管迂曲扩张并形成大量新生血管,经索拉非尼治疗后,视网膜新生血管大幅度减少,且呈剂量依赖性。A组、B组、C组、D组、E组、F组血管分支点数目分别为(16.50±3.90)个、(37.44±6.47)个、(37.08±5.10)个、(30.80±6.85)个、(26.08±5.08)个、(19.83±3.51)个;除B组与C组差异无统计学意义外,其余各组间差异均有统计学意义(均为P<0.05)。HE染色显示,B组和C组有大量突破内界膜的血管内皮细胞核,经索拉非尼治疗后,突破内界膜的血管内皮细胞核明显减少,且呈剂量依赖性。A组、B组、C组、D组、E组、F组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数分别为(0.22±0.42)个、(35.66±4.70)个、(35.30±4.54)个、(27.30±4.28)个、(21.41±3.53)个、(7.41±2.87)个;除B组与C组间差异无统计学意义外,其余各组间差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论索拉非尼能够有效抑制大鼠OIR模型视网膜新生血管的生成,且抑制效果呈剂量依赖性。

夜间光照对氧诱导的视网膜病变小鼠视网膜新生血管形成的影响

背景氧诱导的视网膜新生血管形成是多种视网膜血管性疾病的病理学基础，预防视网膜新生血管的形成可缓解视网膜病变对视网膜的损害程度。研究表明夜间睡眠时给予光照可能对早期糖尿病视网膜病变（DR）患者有利，但其对早产儿视网膜病变（ROP）患者视网膜新生血管有无影响报道较少。目的观察夜间光照对氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠视网膜新生血管形成的影响。方法将64只SPF级新生C57BL／6J小鼠按随机数字表法随机分为正常对照组、单纯夜间光照组、OIR模型组、OIR联合夜间光照组，每组16只小鼠。正常对照组和单纯夜间光照组小鼠生长于正常空气（氧体积分数21％）；OIR模型组和OIR模型联合夜间光照组小鼠于出生后第7天置于高氧环境（75％±2％）生长，出生第12天调整氧体积分数为正常；OIR联合夜间光照组和单纯夜间光照组于出生后第12～17天给予夜间光照，光照度为100lx。各组小鼠均于出生后第17天摘除眼球，采用ADP酶法制备视网膜铺片，了解视网膜血管的改变情况；视网膜组织切片行苏木精一伊红染色并计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数；免疫组织化学法观察各组小鼠视网膜中血管内皮生长因子（VEGF）的表达，实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测各组视网膜中VEGFmRNA的表达。实验动物的使用和喂养遵循ARVO声明。结果正常对照组和单纯夜间光照组小鼠视网膜血管形态均无明显差异。OIR模型组视网膜铺片显示视网膜中央部大片无血管区，大量结构异常的新生血管形成。与OIR模型组相比，OIR模型联合夜间光照组视网膜中央无血管区面积以及新生血管分布密度减少。在实验后第17天时，正常对照组和单纯夜间光照组视网膜新生血管内皮细胞核数分别为（0．97±0．83）个和（1．00±0．72）个，OIR模型组为（38．57±5．01）个，而OIR联合夜问光照组小鼠视网膜新生血管内皮细胞核数为（16．92±3．39）个，总体差异有统计学意义（F=78．767，P=0．000），OIR联合夜间光照组视网膜新生血管内皮细胞核数明显少于OIR模型组，差异有统计学意义（t=20．446，P〈O．01）。免疫组织化学法检测显示OIR模型联合夜间光照组中VEGF蛋白表达明显少于OIR模型组。正常对照组、单纯夜间光照组、OIR模型组和OIR联合夜间光照组小鼠视网膜VEGFmRNA相对表达量分别为1．00±0．00、0．94±0．07、2．08±0．50和1．43±0．21，各组间的总体差异有统计学意义（F=11．268，P=0．003），OIR模型联合夜间光照组表达较01R模型组下调，差异有统计学意义（t=20．163，P〈0．05）。结论夜间光照可减少OIR小鼠视网膜新生血管的形成。

多巴胺对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的影响

目的观察多巴胺(DA)及多巴胺D2受体(DRD2)在氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型中对视网膜新生血管的作用。方法随机将180只小鼠分为空白组、OIR组、NaCl组、DA组、Quinpirole(DRD2激动剂)组、Spiperone(DRD2抑制剂)组,每组30只。空白组小鼠在正常环境中饲养,其他各组小鼠在7 d龄时于高氧环境中饲养5 d,于小鼠12 d龄时返回正常环境中,OIR组不做药物干预,NaCl组、DA组、Quinpirole组分别于小鼠右眼玻璃体内注射8.5 g·L^(-1)NaCl、15 mmol·L^(-1)的DA溶液、602μmol·L^(-1)的Quinpirole溶液,Spiperone组小鼠右眼玻璃体内依次注射154μmol·L^(-1)的Spiperone溶液和15 mmol·L^(-1)的DA溶液各1μL。小鼠17 d龄时处死,摘取右侧眼球进行后续实验。采用苏木精-伊红(HE)染色和视网膜铺片检查各组小鼠视网膜新生血管情况;采用Q-PCR和Western blot检测各组小鼠视网膜中血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白的相对表达量。结果OIR组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、新生血管面积占比、VEGF mRNA和蛋白相对表达量均明显高于空白组(均为P<0.05);NaCl组和Spiperone组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、新生血管面积占比、VEGF mRNA和蛋白相对表达量与OIR组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05);与OIR组相比,DA组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、新生血管面积占比、VEGF mRNA和蛋白相对表达量均降低(均为P<0.05);与DA组相比,Quinpirole组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、新生血管面积占比、VEGF mRNA和VEGF蛋白相对表达量均降低(均为P<0.05)。结论DA可以通过激活DRD2途径来抑制VEGF的表达,从而减少OIR小鼠视网膜新生血管的产生。

α-黑素细胞刺激素抑制氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的生成

背景视网膜新生血管形成（RNV）可发生于多种眼病，导致视网膜出血甚至脱离，抑制病理性RNV已逐渐成为眼科疾病治疗中的重点。α-黑素细胞刺激素（α-MSH）对视网膜发育过程中的生理性血管生成有抑制作用，但其在病理性RNV方面的作用尚未见报道。目的以氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠为模型，研究玻璃体腔注射不同质量浓度的α-MSH对病理性RNV的作用。方法选取健康清洁级7日龄C57BL／6J幼鼠40只，应用随机数字表法随机分为OIR＋0．33μg／μl α-MSH组、OIR＋1．67μg／μl α-MSH组、OIR＋3．30μg／μl α-MSH组、OIR组和正常对照组，每组8只。不同剂量α-MSH干预组和OIR组幼鼠在氧体积分数（75±2）％的高氧环境下饲养5d，然后在普通空气环境中饲养5d，正常对照组幼鼠则在普通空气环境中饲养10d。各组取17日龄鼠，球后静脉注射高相对分子质量异硫氰酸葡聚糖（FITC—dextran），制备视网膜铺片，观察视网膜的血管形态，计算无灌注区面积相对于整个视网膜的面积。对小鼠眼球行石蜡切片和苏木精-伊红染色，计数突破内界膜突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数。结果视网膜铺片结果显示，正常对照组、OIR组、OIR＋0．33μg／μl α-MSH组、OIR＋1．67μg／μl α-MSH组和OIR＋3．30μg／μl α-MSH组视网膜无灌注区相对面积分别为（0．00±0．00）％、（23．01±3．39）％、（18．14±7．20）％、（15．64±7．07）％和（7．62±6．52）％，各组间视网膜无灌注区相对面积总体比较，差异有统计学意义（F=19．635，P〈0．05）；其中OIR组无灌注区相对面积显著高于OIR＋3．30μg／μl α-MSH组，差异有统计学意义（t=4．293，P〈0．01）。组织病理学检查结果显示，正常对照组、OIR组、OIR＋0．33μg／μl α-MSH组、OIR＋1．67μg／μl α-MSH组和OIR＋3．30μg／μl α-MSH组突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数分别为（0．00±0．00）、（11．45±4．26）、（6．35±2．34）、（4．96±1．79）和（1．03±1．25）个。各组突人玻璃体腔的新生血管内皮细胞核数总体比较，差异有统计学意义（F=147．87，P〈0．05）；其中OIR组突入玻璃体腔新生血管内皮细胞核数显著高于OIR＋0．33μg／μl α-MSH组、OIR＋1．67μg／μl α-MSH组和OIR＋3．30μg／μl α-MSH组，差异均有统计学意义（均P〈0．001）。结论α-MSH可减少OIR小鼠模型视网膜中无灌注区的相对面积和视网膜新生血管核数，其对病理性RNV的抑制作用呈剂量依赖性。

抗血管内皮生长因子对氧诱导视网膜新生血管病变模型小鼠视网膜多巴胺含量的影响

目的研究抗血管内皮生长因子(VEGF)融合蛋白康柏西普(Conbercept)玻璃体内注射对小鼠氧诱导视网膜新生血管病变(OIR)模型中视网膜多巴胺(DA)含量的影响。方法普通级7 d龄C57BL/6小鼠100只,随机分为空白对照组、OIR组、OIR+生理盐水(NS)组及OIR+Conbercept组,每组25只。其中空白对照组小鼠在常氧环境中饲养至17 d龄。OIR组、OIR+NS组及OIR+Conbercept组小鼠通过高流量吸氧建立OIR模型,并在此环境中饲养至12 d龄,OIR+NS组和OIR+Conbercept组小鼠分别行右眼玻璃体内注射1μL NS、1μL Conbercept后,在常氧环境中饲养至17 d龄,处死。取各组小鼠右眼眼球行HE染色及视网膜铺片,观察突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数及血管分布;行Western blot检测各组小鼠视网膜中酪氨酸羟化酶(TH)、血管内皮生长因子(VEGF)表达量;行高效液相色谱仪检测各组小鼠视网膜DA含量。结果空白对照组小鼠视网膜各层清晰,未见明显无灌注区及新生血管。与空白对照组相比,OIR组小鼠视网膜各层排列紊乱,视盘周围可见大片无灌注区,突破内界膜的血管内皮细胞核数、VEGF相对表达量均增加,TH相对表达量、DA含量均减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05);OIR+NS组与OIR组相比,小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05);与OIR组及OIR+NS组相比,OIR+Conbercept组小鼠视网膜各层排列较清晰,视盘周围可见小片状无灌注区,突破内界膜的内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量均减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论OIR模型中视网膜DA含量及TH相对表达量均降低;玻璃体内注射Conbercept后,视网膜新生血管及VEGF相对表达量均减少,TH相对表达量、DA含量均进一步降低。

甲酰肽受体Fpr2在氧诱导视网膜病变小鼠新生血管形成中的作用及相关机制研究

目的探讨甲酰肽受体Fpr2在氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠中对胶质细胞改变的影响,并探讨其在新生血管形成中的作用及机制。方法将新生C57BL/6J小鼠、Fpr2^(-/-)小鼠分别诱导建立OIR模型后分为氧诱导组和Fpr2^(-/-)氧诱导组。正常对照组和Fpr2^(-/-)组小鼠正常环境饲养。收集各组小鼠视网膜组织并制作成冰冻切片,免疫荧光染色观察小鼠视网膜中波形蛋白(Vimentin)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和离子化钙结合适配分子1(IBA1)变化;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测小鼠视网膜中炎症因子mRNA的表达;Western blot检测小鼠视网膜中细胞外调节蛋白激酶(ERK)和P38的蛋白磷酸化表达。免疫荧光染色法观察小鼠视网膜中新生血管和无灌注区情况。结果免疫荧光染色结果显示,与正常对照组相比,氧诱导组和Fpr2^(-/-)氧诱导组小鼠视网膜中Vimentin、GFAP、IBA1表达均明显增加,而与氧诱导组相比,Fpr2^(-/-)氧诱导组小鼠视网膜中Vimentin、GFAP、IBA1表达均降低(均为P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,与Fpr2^(-/-)氧诱导组相比,氧诱导组小鼠视网膜中白细胞介素-1β(IL^(-1)β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)mRNA相对表达量均增加(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,氧诱导组和Fpr2^(-/-)氧诱导组小鼠视网膜中p-ERK 1/2和p-P38蛋白相对表达量均增加,而与氧诱导组相比,Fpr2^(-/-)氧诱导组小鼠视网膜中p-ERK 1/2和p-P38蛋白相对表达量均减少(均为P<0.05)。与氧诱导组相比,Fpr2^(-/-)氧诱导组小鼠视网膜中新生血管形成和无灌注区面积均减少(均为P<0.05)。结论抑制Fpr2能够抑制OIR模型小鼠视网膜胶质细胞活化,下调炎症因子表达,减少视网膜新生血管形成和无灌注区面积,此过程中涉及ERK、P38信号通路的作用。

VEGFR-1和VEGFR-2在氧诱导视网膜病变小鼠视网膜中表达的变化

背景 早产儿视网膜病变（ROP）是氧动力学异常导致严重视网膜血管病变的致盲眼病.血管内皮生长因子（VEGF）在ROP发病机制中发挥重要作用,但VEGF受体（VEGFR）在ROP发病中的作用研究较少. 目的 研究不同鼠龄氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠视网膜中VEGFR-1和VEGFR-2的表达变化.方法 将60只SPF级出生后7 d（P7）的C57BL/6J小鼠与哺乳母鼠一起在体积分数（75＆#177;2）％O2条件下饲养5d,建立OIR小鼠模型（OIR组）,以60只正常环境饲养的同品系同龄小鼠作为正常对照组.分别于P8、P11、P12、P13、P14、P18鼠龄时摘取2个组小鼠双侧眼球,制备视网膜切片,采用苏木精-伊红染色法检测小鼠视网膜血管的发育情况;采用实时荧光定量PCR法检测不同鼠龄小鼠视网膜中VEGFR-1和VEGFR-2 mRNA的相对表达水平;采用免疫组织化学法观察小鼠视网膜中VEGFR-1和VEGFR-2蛋白的表达.结果 组织病理学结果显示,OIR组P13、P14、P18小鼠有较多的血管内皮细胞核突破内界膜,光学显微镜下内界膜下的细胞增生,排列紊乱,视网膜表面或视网膜前有新生血管芽,但正常对照组各鼠龄小鼠视网膜结构正常.OIR组P12、P13、P14和P18小鼠视网膜中VEGFR-1 mRNA的平均相对表达水明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（P=0.046、0.000、0.000、0.042）;OIR组P8、P11、P12、P13、P14和P18小鼠视网膜中VEGFR-2mRNA的平均相对表达水平明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（均P＜O.01）.两个组间P8、P11、P12、P13、P14、P18小鼠视网膜中VEGFR-1蛋白阳性表达强度的差异均无统计学意义（M=50.00、36.00、41.00、31.00、28.00、36.00,均P＞0.05）;正常对照组与OIR组间P8和P11小鼠视网膜中VEGFR-2蛋白阳性反应强度的差异无统计学意义（均P＞0.05）,正常对照组P12、P13小鼠视网膜中VEGFR-2蛋白的表达减弱,但OIR组同鼠龄小鼠视网膜中VEGFR-2蛋白的表达增强,2组间差异均有统计学意义（均P＜0.01）;2个组P14小鼠视网膜中VEGFR-2蛋白表达均明显增强,但OIR组的表达强度仍显著高于正常对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）.正常对照组P18小鼠视网膜中VEGFR-2蛋白表达减弱,OIR组VEGFR-2表达强度达峰（M=20.11,P＜0.01）. 结论 VEGFR参与OIR小鼠视网膜新生血管的形成,VEGFR-2的促新生血管新生作用强于VEGFR-1.

脯氨酸羟化酶2对氧诱导视网膜病变新生血管生成的影响

目的观察脯氨酸羟化酶2(proline hydroxylase2,PHD2)对氧诱导小鼠视网膜病变动物模型新生血管生成的影响。方法 40只7d龄的C57BL/6J幼鼠随机分为4组,即正常对照组、高氧组、300mg.kg-1和500mg.kg-1PHD2抑制剂处理组,每组各10只。后3组放入动物氧舱,在氧气含量为体积分数(75±2)%的高氧环境中连续饲养5d,正常对照组于正常大气环境中饲养。300mg.kg-1和500mg.kg-1PHD2抑制剂处理组在结束高浓度给氧后,腹腔注射不同剂量的PHD2抑制剂(黄芩素),高氧组和正常对照组给予腹腔注射生理盐水,每天1次,连续5d。于末次注射结束后处死小鼠,Western blotting法检测视网膜中PHD2蛋白的表达,视网膜铺片法观察视网膜血管的情况,HE染色后计数突破内界膜的内皮细胞核数,免疫组织化学法检测视网膜a-SMA和VEGF蛋白的表达。结果 Western blotting显示视网膜中存在PHD2蛋白的表达,且高氧组蛋白表达量明显高于正常对照组(P=0.002),正常对照组高于300mg.kg-1、500mg.kg-1PHD2抑制剂组(P=0.004、0.001)。视网膜铺片结果显示高氧组自视盘发出的血管扩张迂曲,中周部视网膜有大量新生血管生成,近视盘周围有明显的血管无灌注区;300mg.kg-1和500mg.kg-1PHD2抑制剂处理组较高氧组明显改善。突破视网膜内界膜的内皮细胞核数正常对照组、高氧组、300mg.kg-1和500mg.kg-1PHD2抑制剂处理组分别为(0.60±0.84)个、(39.40±5.17)个、(15.80±1.93)个和(6.30±1.57)个,4组比较差异有统计学意义(P<0.05),高氧组最多,正常对照组最少。免疫组织化学染色结果显示300mg.kg-1和500mg.kg-1PHD2抑制剂处理组a-SMA表达较高氧组明显增加;高氧组、300mg.kg-1及500mg.kg-1PHD2抑制剂处理组的VEGF表达量均较正常对照组明显升高,300mg.kg-1和500mg.kg-1PHD2抑制剂处理组与高氧组比较,VEGF表达量无明显降低。结论视网膜存在PHD2的表达,抑制其表达后能有效改善高氧所致小鼠视网膜血管的异常,提示PHD2可能在其发病机制中具有一定的作用。

氧诱导鼠视网膜病变中低氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子的表达

目的:探讨HIF-1α和VEGF在早产儿视网膜病变鼠模型中的表达及意义。方法:建立氧诱导的早产儿视网膜病变新生鼠模型。Western-blot检测视网膜HIF-1α的表达,并以计算机图像分析仪进行分析;ELISA方法检测视网膜VEGF的表达。结果:与正常对照组比较,视网膜病变组在鼠出氧箱后5,10,15d视网膜HIF-1α表达逐渐增加(P<0.01),呈时间依赖关系。视网膜VEGF的表达分别为381.5±3.1,431.8±1.3和443.9±1.2ng/L,与对照组比较,均有显著增加(P<0.01)。结论:氧诱导视网膜病变中的HIF-1α和VEGF上调。

Dll4、Notch1在大鼠氧诱导性视网膜病变模型中的表达

目的观察Dll4、Notch1在大鼠氧诱导性视网膜病变(oxygen induced retinopathy,OIR)模型中的表达情况,探讨其在视网膜新生血管形成过程中的作用。方法取70只出生5 d的SD大鼠随机分为实验组和对照组。实验组大鼠35只置于体积分数80%高氧环境7 d建立OIR模型,对照组35只大鼠置于正常空气中。两组大鼠分别于生后第12天和第17天取材,通过ADP酶视网膜铺片、HE染色视网膜切片观察实验组与对照组视网膜血管形态及新生血管生长情况,应用Western blot和RTPCR的方法检测Dll4、Notch1蛋白及其mRNA的表达水平。结果苏木精-伊红染色视网膜切片可见,实验组大鼠视网膜新生血管数量及突破内界膜的血管内皮细胞数量较对照组显著增多;对照组每眼突破内界膜的血管内皮细胞核数为0.10±0.32,实验组为32.30±4.85,两组差异有统计学意义(P=0.000)。ADP酶视网膜铺片显示,在OIR造模后12 d中,大鼠视网膜血管普遍收缩闭塞,视网膜后极部及中周部出现大片无血管区;17 d时,后极部视网膜血管扩张、迂曲,在视网膜周边部存在无血管区,在有血管区和无血管区的交界处可见新生血管簇形成。实验组Dll4、Notch1蛋白及其mRNA在造模后12 d大鼠视网膜中表达降低,而在17 d时表达增高,实验组12 d与17 d之间,以及实验组与对照组同时间点之间比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 Dll4-Notch1信号途径在视网膜新生血管形成的过程中可能具有潜在功能。