氧诱导视网膜病变小鼠模型新生血管变化规律及VEGF的动态表达

目的观察氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy,OIR)小鼠模型新生血管变化规律及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的动态表达,利用VEGF的变化反映OIR模型视网膜组织中新生血管的发生发展。方法80只C57BL/6J新生幼鼠随机分为OIR组和对照组,每组各40只。OIR组7d龄鼠暴露在(75±2)%浓度的高氧状态下5d,随后在正常空气环境下饲养;对照组小鼠,均在正常空气环境下饲养。2组均于12d龄(P12)、14d龄(P14)、17d龄(P17)、21d龄(P21)随机抽取2组小鼠各10只(20眼)处死,利用视网膜组织切片,HE染色计数突破视网膜内界膜的内皮细胞核数,分析视网膜新生血管增生情况;实时荧光定量RT-PCR(real time RT-PCR)观察VEGF mRNA的动态表达规律。结果突破视网膜内界膜的内皮细胞核数显示对照组小鼠视网膜新生血管P12、P14、P17、P21分别为0.27±0.12、0.30±0.15、0.31±0.13、0.40±0.17,自始至终很少见到突破内界膜的内皮细胞核;OIR组小鼠视网膜新生血管P12、P14、P17、P21分别为0.41±0.16、10.25±2.68、34.14±1.79、8.12±2.13,P17达高峰,以后逐渐下降。real time RT-PCR显示对照组视网膜病变中VEGF mRNAP12、P14、P17、P21分别为9.29±0.13、9.52±0.17、10.49±0.24、10.51±0.29;P12时表达相对较高,以后逐渐下降。OIR组视网膜病变中VEGF mRNAP12、P14、P17、P21分别为10.45±0.11、7.41±0.48、8.53±0.32、10.56±0.17;P12表达较低,P14达高峰,以后逐渐下降。2组VEGF mRNA P12、P14、P17时表达差异均有统计学意义(均为P<0.05),在P21时表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论VEGF是重要的血管生成因子,利用VEGF mRNA的动态表达可以映射视网膜新生血管的发生发展过程,为进一步研究奠定基础。

氧诱导视网膜病变小鼠模型的蛋白表达谱分析

背景视网膜新生血管（RNV）是目前世界范围内主要的致盲原因之一，而目前的治疗效果并不理想，因此需要寻找在疾病状态下异常表达的蛋白质标志物，为新生血管性视网膜疾病的治疗提供新的靶点。目的观察氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型中视网膜血管的形态学特征，筛选并验证差异性表达的蛋白质分子。方法选取7日龄健康清洁级C57BL／6J幼鼠44只，分为OIR组和正常对照组。OIR组幼鼠先在氧体积分数为（75±2）％的环境下饲养5d，然后在正常空气环境中饲养5d，而正常对照组幼鼠仅在正常空气环境下饲养10d。取17日龄幼鼠经球后静脉注射高分子量异硫氰酸葡聚糖（FITC-dextran），然后制备视网膜铺片，观察视网膜血管的形态并统计视网膜无灌注区相对面积；取各组小鼠眼球行石蜡切片和苏木精一伊红染色，计数突破内界膜的血管内皮细胞核数；采用蛋白芯片法检测蛋白质分子在OIR组和正常对照组小鼠眼球中的差异性表达，并用Western blot法和ELISA法对差异表达蛋白进行验证。结果视网膜铺片结果显示，OIR组小鼠视网膜周边血管紊乱，静脉血管迂曲，视网膜中央有明显的无灌注区，在视网膜灌注区和无灌注区的交界处有大量新生血管芽，而正常对照组视网膜血管细密，静脉平滑，分布均匀整齐。OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积为（25．53±2．16）％，较正常组无灌注区的相对面积（0．66±0．36）％明显增加，差异有统计学意义（t=-27．61，P〈0．01）。石蜡切片苏木精-伊红染色结果表明，OIR组小鼠视网膜平均每张切片突人玻璃体腔的血管内皮细胞核数为（28．41±3．97）／切片，而正常组为（0．16±0．31）／切片，两组间比较差异有统计学意义（t=-54．42，P〈0．001）。蛋白芯片检测结果显示，在检测的62个与新生血管和炎症相关的细胞因子中，表达变化达1．5倍以上者10个，包括3个上调因子和7个下调因子；表达变化达2倍以上的细胞因子4个，包括3个下调因子和1个上调因子。对表达差异最显著的6个细胞因子（上调、下调各3个）进行Western blot和ELISA验证，结果表明血小板因子4（PF-4）、血管内皮生长因子A（VEGF—A）、P-选择素（SELP）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）、可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ（sTNF—RⅡ）以及趋化因子半胱氨酸-X-半胱氨酸基元配体16（CXCL16）的表达与蛋白芯片检测的表达趋势一致，其中PF-4、SELP和VEGF—A在OIR眼球中表达显著上调，CXCLl6、sTNF—RⅡ和VCAM-1在OIR眼球中的表达显著下调，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论本研究成功建立OIR小鼠模型。细胞因子PF-4、SELP、VEGF—A、CXCL16、sTNF—RⅡ和VCAM-1在OIR模型和正常对照小鼠的眼球组织中的表达存在显著差异，提示OIR状态下血小板系统处于激活状态，而促炎因子表达下调。PF-4可能成为针对RNV的VEGF非依赖型治疗策略的新靶点。

miR-20a-5p调节VEGF通路在氧诱导视网膜病变小鼠模型中的作用机制

目的探讨微小RNA(miR)-20a-5p调节血管内皮生长因子(VEGF)通路在氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠中的作用机制。方法实验分为正常组、模型组、高氧对照组、miR-20a-5p高表达组,每组24只。除正常组外,其余组小鼠在出生后第7天置于氧浓度(75.00±2.00)%氧箱中建立OIR小鼠模型,连续高氧环境5 d后置于常氧中饲养。高氧环境结束前1 d,高氧对照组玻璃体腔内注射1μL磷酸缓冲盐溶液(PBS),miR-20a-5p高表达组玻璃体腔内注射1μL miR-20a-5p激动剂(miR-20a-5p agomir)(1μmol/L),模型组不进行任何处理。正常组一直置于空气中正常饲养。高氧结束后各组小鼠正常空气再饲养5 d进行实验。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测视网膜组织miR-20a-5p、VEGF、血管内皮生长因子受体(VEGFR)-1、VEGFR-2表达情况;视网膜铺片观察视网膜血管形态;苏木精-伊红(HE)染色计数视网膜新生血管内皮细胞核情况;免疫组化检测视网膜组织中VEGF阳性细胞情况。结果模型组和高氧对照组在出生第17天自视盘向周围发出的放射状大血管迂回、不规则扩张,出现大量新生血管,且新生血管结构及分布紊乱,周边毛细血管网闭塞;miR-20a-5p高表达组相较模型组和高氧对照组在出生第17天自视盘向周围发出的放射状大血管迂回不明显,血管不规则扩张现象减轻,新生血管明显减少。与正常组相比,模型组、高氧对照组视网膜组织中miR-20a-5p水平降低(P<0.05),视网膜血管内皮细胞核数量、VEGF蛋白阳性面积百分比、视网膜组织中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA表达水平升高(P<0.05);分别与模型组、高氧对照组相比,miR-20a-5p高表达组视网膜组织中miR-20a-5p水平升高(P<0.05),视网膜血管内皮细胞核数量、VEGF蛋白阳性面积百分比、视网膜组织中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2mRNA表达水平降低(P <0.05)。结论升高miR-20a-5p可抑制VEGF通路从而减少OIR小鼠视网膜血管新生,实现对OIR小鼠视网膜的保护。

氧诱导视网膜病变小鼠模型血管改变与PEDF表达变化规律

目的观察色素上皮衍生因子(PEDF)在氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型的表达规律,探讨PEDF与视网膜血管改变的关系及意义。方法建立OIR小鼠模型并设立对照组,于不同日龄分批处死,制作视网膜组织石蜡切片,HE染色计数突破视网膜内界膜的内皮细胞核分析视网膜新生血管增生情况,利用免疫组织化学染色的方法观察PEDF表达的时空规律。结果高氧组小鼠视网膜新生血管形成,14日龄、17日龄、21日龄平均每张切片突破内界膜的内皮细胞核数分别为(18.75±4.21)个、(41.90±8.36)个和(22.65±4.57)个,与对照组比较差异具有显著性(P<0.001)。12日龄高氧组视网膜PEDF表达较对照组增强(P=0.001),17日龄时则较对照组减弱(P<0.001),PEDF表达强度呈现与血管增生相反方向的改变。对照组随着日龄的增加PEDF表达逐渐增强,高氧组小鼠高氧环境下PEDF表达增强,而相对低氧后表达减弱,两组PEDF表达呈现不同的变化规律。结论PEDF是重要的抑血管因子,其表达的增强或减弱与视网膜血管退行或新生血管增殖密切相关。

氧诱导视网膜病变小鼠模型的研究进展

视网膜新生血管性疾病是一类严重的致盲性疾病,构建与之相关的动物模型是进行该疾病机制研究的重要基础,有利于在临床中更好地预防、诊断和治疗。氧诱导视网膜病变小鼠模型是目前研究视网膜新生血管性疾病最常用的动物模型,此模型构建过程与人类早产儿视网膜新生血管病变的发生、发展极为相似,具有制作方法简单、重复性好等优点。本文重点阐述氧诱导视网膜病变小鼠模型的构建方法及原理,模型相关细胞因子的作用,模型构建的影响因素如动物品种、氧气的百分含量、高氧对母鼠的影响、产后体质量增加量、光照暴露等,并简要介绍模型中常用的量化评估方法,为研究人员准确、有效地构建和评估氧诱导视网膜病变小鼠模型提供帮助。

氧诱导视网膜病变小鼠模型中微小RNA表达分析的内参基因优选

背景 视网膜新生血管常伴随微小RNA（miRNA）表达水平的变化.实时定量PCR是miRNA表达谱分析的常用方法,但内参基因在不同实验条件下可能呈现出差异性表达,如果以表达水平有显著波动的管家基因作为内参基因,可能会影响目的基因表达的结果评估,确定稳定表达的内参基因是进行后续研究的前提. 目的 比较氧诱导视网膜病变（OIR）模型小鼠眼球组织中常用的miRNA内参基因及其他几种内参基因表达水平的差异及稳定性,筛选在OIR模型和正常发育条件下均稳定表达的最佳miRNA内参基因.方法 应用随机数字表法抽取正常清洁级C57BL/6J P7、P12、P17、P37不同日龄小鼠及成年鼠（8周龄）各10只,小鼠在相应时间点颈椎脱臼法处死,收集眼球组织,应用实时定量PCR技术检测用于评估核小分子RNAU6（RNU6）、5S核糖体RNA（5s rRNA）、核仁小分子RNA U68（U68）、核仁小分子RNA U70（U70）、核仁小分子RNA U49A（U49A）5种内参基因在正常发育的不同日龄（P7、P12、P17、P37及成年）小鼠中表达的动态变化;另选取P7幼鼠40只,采用随机数字表法随机分为OIR组和正常对照组,每组20只.正常对照组小鼠在正常氧环境下饲养,OIR组小鼠在体积分数（75＆#177;2）％的高氧环境中饲养10d.分别选取P17 OIR组和正常对照组小鼠各5只,进行球后静脉荧光素视网膜血管造影,并制备视网膜铺片,另各取5只小鼠处死后制备视网膜切片行组织病理学检查,以验证是否造模成功.然后应用实时定量PCR技术检测上述5种内参基因在正常对照组和OIR组小鼠视网膜组织中的表达差异;应用GeNorm程序对内参基因表达的稳定性进行分析. 结果 在不同日龄正常小鼠视网膜中,内参基因U68的表达水平变化最大,其次为U49A、U70、RNU6、5s rRNA;内参基因U68、U49A、U70、RNU6在不同日龄小鼠视网膜中的相对表达量的总体差异均有统计学意义（U70：F=7.005,P=0.000; U68：F=10.189,P=0.000;U49A：F=21.134,P=0.000;RNU6：F=4.968,P=0.004）,而5s rRNA在不同日龄小鼠视网膜中的相对表达量差异无统计学意义（F=2.099,P=0.107）.P17 OIR组小鼠视网膜铺片显示,视网膜血管迂曲,可见视网膜无灌注区,苏木精-伊红染色可见突破视网膜内界膜的新生血管芽,而正常对照组小鼠视网膜均正常.在P17 OIR组小鼠内参基因U70表达水平变化最大,其次为U49A、U68、5s rRNA;U70、U49A、U68、5s rRNA在OIR组和正常对照组小鼠视网膜中表达量的差异均有统计学意义（t=5.174,P=0.000;t=3.376,P=0.012;t=4.802,P=0.000;t=2.856,P=0.029）,RNU6的相对表达量在2个组间的差异无统计学意义（t=2.104,P=0.065）.GeNorm程序分析结果显示,不同日龄的正常小鼠眼球中所选内参基因表达稳定度为5s rRNA/RNU6＞ U70＞ U49A＞ U68,最佳内参基因组合为5s rRNA和RNU6;在P17OIR组小鼠眼球组织中所选内参基因的表达稳定度为5s rRNA/RNU6＞ U68＞ U49A＞ U70,最佳内参基因组合亦为5s rRNA和RNU6.结论 应用实时定量PCR技术研究miRNA基因表达时,应根据不同的研究对象和处理条件选择合适的内参基因.在OIR模型中,综合考虑发育、缺氧等因素的影响,在条件允许的情况下可优先选择5s rRNA和RNU6组合作为小鼠眼球组织miRNA表达分析的内参基因.

氧诱导视网膜病变模型小鼠肾组织代谢组学研究

目的探讨高氧环境对氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠肾脏代谢物的影响,了解病理性视网膜血管新生和肾损伤之间的潜在机制。方法采用随机数字表法将16只健康SPF级C57/B6J新生小鼠随机分为OIR组与正常对照组,每组8只。小鼠自出生后标准饲养至第7天(P7),OIR组小鼠和母鼠置于(75±2)%的高氧箱中饲养至P12,然后正常饲养;正常对照组一直在正常环境下饲养。各组小鼠在饲养P17时采用二氧化碳安乐死,取视网膜组织铺片并行血管异凝集素(IB4)染色,观察视网膜血管形态、中央无灌注区及病理性新生血管情况;另取小鼠肾组织进行液相色谱-质谱分析,取其对应小鼠的全血进行抗凝处理,通过离心沉淀,获得不含细胞成分的血浆,对血浆进行靶向代谢组学分析。使用代谢组学数据处理软件Progenesis QI v2.3对质谱信息进行解析,用无监督的主成分分析及正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)来区分各组间代谢轮廓的总体差异,比较2个组间代谢物的倍数变化。以变量权重值>1且P<0.05为条件筛选出差异代谢物。基于KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路富集分析。结果视网膜铺片IB4染色结果显示,P17时正常对照组小鼠视网膜血管分布均匀;OIR组小鼠视网膜周边血管迂曲、紊乱,中央可见大面积无灌注区域形成,在视网膜无灌注区和血管区交界处形成大量新生血管簇,呈强荧光染色。OIR组小鼠视网膜无灌注区相对面积为(25.16±3.50)%,明显大于正常对照组的(0.63±0.30)%,差异有统计学意义(t=12.07,P<0.001)。OPLS-DA模型参数R2X cum、解释率R2Y cum、和预测率Q2 cum分别为0.578、0.978和0.857,表明OPLS-DA模型具有较好的预测能力。共筛选鉴定到26个主要的差异代谢物,其中上调表达17个,下调表达9个,包括甘油磷脂类化合物[PC 20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0∶0、PC 22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0∶0、PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)、PE P-18∶0/20∶4(6E,8Z,11Z,14Z)(5OH[S])]、氨基酸类代谢物(精氨酸、鸟氨酸、哌可酸和羟基赖氨酸)、嘌呤类(鸟嘌呤、次黄嘌呤、羟嘌醇)和脂肪酸类(15-棕榈酸甲酯、2,6,8,12-Tetramethyl-2,4-tridecadien-1-ol)等。差异代谢物主要富集于ABC转运蛋白(L-精氨酸、牛磺酸、肌醇、腺苷、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖、L-谷氨酰胺)、氨酰-tRNA生物合成(L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酰胺)、精氨酸生物合成(L-精氨酸、L-鸟氨酸、L-谷氨酰胺)等代谢通路。血浆的靶向代谢组学结果显示,差异的氨基酸类代谢产物主要富集于氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成代谢以及ABC转运蛋白等代谢通路。结论OIR小鼠的ABC转运蛋白、氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成代谢通路可能参与了肾损伤及早产儿视网膜病变新生血管形成的病理变化过程。

芪灯明目胶囊对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜血管的保护作用

目的研究芪灯明目胶囊对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管形成及重塑的影响。方法将36只出生后第7天的(P7)SPF级C57BL/6J幼鼠采用随机数字表法分为正常组、OIR组、芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组,每组9只。正常组小鼠于正常环境下饲养,其余小鼠均在高氧环境中[氧浓度为(75±2)%]饲养5 d(P7~P12)后再在正常环境中饲养5 d(P12~P17)建立OIR模型。芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组从P12开始分别给予芪灯明目胶囊(900 mg/kg)与血管内皮生长因子受体2抑制剂阿帕替尼(70 mg/kg)灌胃,1次/d,连续5 d。P17时,摘取小鼠眼球,制作眼球石蜡切片并行苏木精-伊红染色,计数各组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞数目;制作视网膜铺片并行FITC-dextran荧光染色,计算视网膜无灌注区面积比、新生血管密度与总血管密度;采用免疫荧光染色法检测视网膜血管内皮细胞标志物CD31与周细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的分布和荧光强度;采用免疫组织化学染色法检测视网膜缺氧诱导因子1α(HIF-1α)与血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)的表达分布。结果正常组、OIR组、芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组突破内界膜的血管内皮细胞数目分别为(2.83±4.40)、(37.33±5.43)、(23.83±6.79)和(14.00±9.34)个,总体比较差异有统计学意义(F=28.313,P<0.001),其中OIR组突破内界膜血管内皮细胞数明显多于正常组、芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。视网膜铺片结果显示,OIR组视网膜存在大片无灌注区域与新生血管芽,血管迂曲,分布紊乱,芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组血管分布较OIR组更均匀,无灌注区面积和新生血管较OIR组减少。正常组、芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组视网膜无灌注区面积比和新生血管密度均较OIR组降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常组、芪灯明目胶囊组和阿帕替尼组CD31免疫荧光强度和HIF-1α吸光度值明显低于OIR组,α-SMA免疫荧光强度和VE-cadherin吸光度值明显高于OIR组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论芪灯明目胶囊能够抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成,增加血管周细胞覆盖,缓解视网膜缺氧以及增加血管完整性,对OIR小鼠视网膜血管起到保护作用。

雷珠单抗对氧诱导视网膜病变模型小鼠视网膜色素上皮衍生因子和高迁移族率蛋白1表达的影响

目的通过玻璃体腔内注射雷珠单抗,观察小鼠氧诱导视网膜病变模型(OIR)中视网膜色素上皮衍生因子(PEDF)和高迁移族率蛋白1(HMGB1)的表达,探讨雷珠单抗对缺血缺氧性视网膜病变的保护作用和机制。方法取7日龄健康级C57/B6J新生小鼠60只,随机分为正常对照组、OIR组、OIR+雷珠单抗组,每组20只。正常对照组于出生后7 d在正常环境中饲养至17 d,OIR组及OIR+雷珠单抗组于出生后7 d放置于体积分数(75±2)%氧气中,在此环境中饲养至12 d,之后在正常常氧环境中饲养至17 d。期间OIR+雷珠单抗组于12 d行右眼玻璃体腔内药物注射雷珠单抗1μl,各组小鼠均于17 d用1%戊巴比妥钠腹腔注射过量麻醉处死。行HE染色观察细胞形态及新生血管情况;行Western blot检测视网膜中PEDF、HMGB1的表达。结果HE染色结果显示:正常对照组视网膜各层结构清晰,未见血管内皮细胞核突破内界膜;OIR组视网膜各层结构排列紊乱,可见内皮细胞核突破内界膜。Western blot结果显示:与正常对照组比较,OIR组PEDF在视网膜中表达量下降,HMGB1在视网膜中表达量升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);OIR+雷珠单抗组与OIR组比较,PEDF表达量上调,HMGB1表达量下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论OIR模型中PEDF在视网膜中表达量下降,HMGB1在视网膜中表达量上升,两者可能共同参与视网膜新生血管形成及ROP的发展;通过玻璃体腔注射雷珠单抗后,PEDF在视网膜中表达量上升,HMGB1在视网膜中表达量下降,表明雷珠单抗可能通过调节PEDF和HMBG1的表达从而抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管形成。

多巴胺对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的影响

目的观察多巴胺(DA)及多巴胺D2受体(DRD2)在氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型中对视网膜新生血管的作用。方法随机将180只小鼠分为空白组、OIR组、NaCl组、DA组、Quinpirole(DRD2激动剂)组、Spiperone(DRD2抑制剂)组,每组30只。空白组小鼠在正常环境中饲养,其他各组小鼠在7 d龄时于高氧环境中饲养5 d,于小鼠12 d龄时返回正常环境中,OIR组不做药物干预,NaCl组、DA组、Quinpirole组分别于小鼠右眼玻璃体内注射8.5 g·L^(-1)NaCl、15 mmol·L^(-1)的DA溶液、602μmol·L^(-1)的Quinpirole溶液,Spiperone组小鼠右眼玻璃体内依次注射154μmol·L^(-1)的Spiperone溶液和15 mmol·L^(-1)的DA溶液各1μL。小鼠17 d龄时处死,摘取右侧眼球进行后续实验。采用苏木精-伊红(HE)染色和视网膜铺片检查各组小鼠视网膜新生血管情况;采用Q-PCR和Western blot检测各组小鼠视网膜中血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白的相对表达量。结果OIR组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、新生血管面积占比、VEGF mRNA和蛋白相对表达量均明显高于空白组(均为P<0.05);NaCl组和Spiperone组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、新生血管面积占比、VEGF mRNA和蛋白相对表达量与OIR组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05);与OIR组相比,DA组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、新生血管面积占比、VEGF mRNA和蛋白相对表达量均降低(均为P<0.05);与DA组相比,Quinpirole组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、新生血管面积占比、VEGF mRNA和VEGF蛋白相对表达量均降低(均为P<0.05)。结论DA可以通过激活DRD2途径来抑制VEGF的表达,从而减少OIR小鼠视网膜新生血管的产生。

单核细胞趋化蛋白-1在氧诱导视网膜病变新生小鼠模型中的表达

背景单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是趋化因子家族中的主要成员之一，在肿瘤、炎症和糖尿病视网膜病变（DR）等新生血管性疾病中起着重要的作用，但关于MCP-1在氧诱导视网膜病变（OIR）发生过程中的表达及其作用的研究鲜有报道。目的观察OIR小鼠视网膜中MCP-1的表达，探讨MCP-1在视网膜血管发育和视网膜新生血管形成过程中的作用。方法SPF级C57BL／6J小鼠120只，按随机数字表法随机分为OIR组和正常对照组，每组60只。OIR组将出生后7d的新生小鼠在体积分数75％氧环境下饲养5d，然后返回正常大气环境中；正常对照组小鼠始终置于正常大气环境中饲养。OIR组和正常对照组分别在出生后5、7、12、14、17、21d随机抽取10只小鼠，摘除右眼球，采用免疫组织化学法检测MCP-1蛋白在小鼠视网膜中的表达情况，采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测MCP-1mRNA在小鼠视网膜中的表达。结果正常对照组小鼠在出生后的第5天即有MCP-1在视网膜的内核层和节细胞层表达，12d时表达MCP-1的阳性细胞数达到高峰，其他日龄时呈基线表达。OIR组12d时表达MCP-1的阳性细胞数轻度增多，14d时阳性细胞数显著增多，之后迅速下降至正常水平。正常对照组在5d时可检测到MCP-1mRNA表达，12d时显著上调，之后随小鼠日龄的增加，MCP-1mRNA表达迅速下降，14、17、21d表达基本呈基线水平。OIR组12d时，MCP-1mRNA较正常对照组下降，在新生血管形成关键期，即14d时表达显著上调，之后迅速下降至正常水平。OIR组和正常对照组间比较采用完全随机分组的两因素方差分析，F分组=5．230，P=0．028；F日龄6．898，P=0．001。结论小鼠视网膜发育过程始终伴随着MCP-1的表达，MCP-1的表达上调可能与小鼠视网膜血管发育和OIR模型中视网膜新生血管的形成密切相关。

Dll4、Notch1在大鼠氧诱导性视网膜病变模型中的表达

目的观察Dll4、Notch1在大鼠氧诱导性视网膜病变(oxygen induced retinopathy,OIR)模型中的表达情况,探讨其在视网膜新生血管形成过程中的作用。方法取70只出生5 d的SD大鼠随机分为实验组和对照组。实验组大鼠35只置于体积分数80%高氧环境7 d建立OIR模型,对照组35只大鼠置于正常空气中。两组大鼠分别于生后第12天和第17天取材,通过ADP酶视网膜铺片、HE染色视网膜切片观察实验组与对照组视网膜血管形态及新生血管生长情况,应用Western blot和RTPCR的方法检测Dll4、Notch1蛋白及其mRNA的表达水平。结果苏木精-伊红染色视网膜切片可见,实验组大鼠视网膜新生血管数量及突破内界膜的血管内皮细胞数量较对照组显著增多;对照组每眼突破内界膜的血管内皮细胞核数为0.10±0.32,实验组为32.30±4.85,两组差异有统计学意义(P=0.000)。ADP酶视网膜铺片显示,在OIR造模后12 d中,大鼠视网膜血管普遍收缩闭塞,视网膜后极部及中周部出现大片无血管区;17 d时,后极部视网膜血管扩张、迂曲,在视网膜周边部存在无血管区,在有血管区和无血管区的交界处可见新生血管簇形成。实验组Dll4、Notch1蛋白及其mRNA在造模后12 d大鼠视网膜中表达降低,而在17 d时表达增高,实验组12 d与17 d之间,以及实验组与对照组同时间点之间比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 Dll4-Notch1信号途径在视网膜新生血管形成的过程中可能具有潜在功能。

氧诱导的视网膜病变小鼠模型建立方法的改良

目的:建立简单、稳定、成模率高的氧诱导的视网膜病变小鼠模型。方法:用改良法(A组)和传统方法(B组)分别建立氧诱导的视网膜病变的C57BL/6小鼠模型,比较两组的母鼠死亡率、乳鼠成活率和成模率,视网膜冰冻切片GSL染色免疫组化观察两组的视网膜新生血管,荧光素灌注视网膜铺片检测视网膜无灌注区和新生血管的面积。结果:改良法(A组)与传统法(B组)相比较,乳鼠成活率未降低,且具有母鼠死亡率低,成模率高,动物消耗量少的特点。改良法制作的小鼠模型视网膜无灌注区和新生血管面积较传统法多而典型。结论:改良法操作简单,能构建出高效、稳定、典型的视网膜新生血管模型。该方法值得推广和借鉴。

玻璃体内注射索拉非尼对大鼠氧诱导视网膜病变模型新生血管的作用

目的探讨玻璃体内注射索拉非尼对氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)大鼠模型视网膜新生血管的作用。方法 7 d龄SD乳鼠144只,随机分为6组:A组:对照组;B组:ROP组;C组:ROP溶媒对照组;D组:ROP+5μg索拉非尼组;E组:ROP+20μg索拉非尼组;F组:ROP+80μg索拉非尼组。除A组在正常氧环境下饲养外,其余各组乳鼠均建立OIR模型。乳鼠于生后第12天出氧箱后给予玻璃体内注射DMSO及相应剂量的索拉非尼,于生后第17天处死,做视网膜铺片,并于激光共聚焦显微镜下观察视网膜血管形态并在高倍视野下计数血管分支点数目;组织切片HE染色观察视网膜组织形态并计数突破内界膜的血管内皮细胞核数。结果视网膜铺片显示,B组和C组视网膜血管迂曲扩张并形成大量新生血管,经索拉非尼治疗后,视网膜新生血管大幅度减少,且呈剂量依赖性。A组、B组、C组、D组、E组、F组血管分支点数目分别为(16.50±3.90)个、(37.44±6.47)个、(37.08±5.10)个、(30.80±6.85)个、(26.08±5.08)个、(19.83±3.51)个;除B组与C组差异无统计学意义外,其余各组间差异均有统计学意义(均为P<0.05)。HE染色显示,B组和C组有大量突破内界膜的血管内皮细胞核,经索拉非尼治疗后,突破内界膜的血管内皮细胞核明显减少,且呈剂量依赖性。A组、B组、C组、D组、E组、F组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数分别为(0.22±0.42)个、(35.66±4.70)个、(35.30±4.54)个、(27.30±4.28)个、(21.41±3.53)个、(7.41±2.87)个;除B组与C组间差异无统计学意义外,其余各组间差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论索拉非尼能够有效抑制大鼠OIR模型视网膜新生血管的生成,且抑制效果呈剂量依赖性。

CREB1在氧诱导视网膜病变小鼠模型中的表达变化

目的 研究CREB1在氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型视网膜新生血管形成中的表达变化,探寻视网膜新生血管形成的可能机制.方法 实验研究.选用7日龄健康清洁级C57BL/6J小鼠134只,随机分为正常对照组（67只）和OIR模型组（67只）.将小鼠与哺乳母鼠共同置于（75±2）％氧环境内饲养5d后转移至正常环境中饲养5d,建立小鼠OIR模型,17日龄的OIR鼠在空气中再继续饲养4d,正常对照组在正常氧环境中饲养21 d.出生后第17 d时取OIR模型组和正常对照组小鼠制备视网膜切片HE染色法和FITC-dextran心脏灌注视网膜铺片法观察视网膜新生血管情况,以及视网膜组织冰冻切片免疫荧光染色观察P-CREB1表达情况.取2组鼠第7、9、12、14、17、21 d的视网膜采用实时定量聚合酶链反应（real-time PCR）法和Western Blot法检测CREB1mRNA和蛋白在小鼠视网膜中的表达情况.数据分析采用独立样本t检验和两因素方差分析方法,两两比较采用Bonferronipost-test检验.结果 17 d时OIR模型组较正常对照组突破视网膜内界膜的内皮细胞核数明显增加（t=1 1.31,P＜0.05）,且模型组视网膜新生血管区及无灌注区面积分别为（21.40±2.72）％和（30.61±3.12）％.与正常对照组相比,模型组小鼠视网膜中可见大量P-CREB1蛋白荧光,主要表达在内核层和神经节细胞层.Real-time PCR和Western Blot结果表明,正常对照组第7、9、12、14、17天的CREB1mRNA和蛋白在视网膜中的表达水平逐渐升高,21 d时开始出现下降的趋势;在各相应时间点OIR模型组里的CREB1相对表达量除第7天外,其余时间点均高于正常对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 CREB1的表达水平与视网膜新生血管的形成存在时空对应关系,CREB1的高表达可能参与了OIR模型中视网膜新生血管的形成过程.

氧诱导小鼠视网膜病变模型的研究

目的建立对视网膜新生血管进行定量研究的小鼠模型,用于视网膜新生血管发生机制的探讨及治疗方法的评价。方法给氧组16只C57BL/6J小鼠P7到P12置于氧浓度为70%±5%的氧箱,诱导视网膜新生血管形成。对照组16只C57BL/6J小鼠生活在正常氧环境中作为对照。P17各再随机分成两组,一组FITC-Dextran灌注后,视网膜铺片,在荧光显微镜下观察视网膜血管生长情况并行视网膜病变评分,视网膜病变评分包括血管生长、血管丛、视网膜外新生血管、中央血管收缩、视网膜出血和血管扭曲;另一组PAS-苏木精染色作眼球冰冻切片,计数突破内界膜的内皮细胞数。结果给氧组视网膜血管分布及形态较对照组有明显差异,给氧组视网膜中央毛细血管闭塞,大血管管径粗细不均,周边更扭曲,血管丛增生,荧光素渗漏。给氧组视网膜病变总分用四分位数表示为10(9,10),而对照组为0.5(0,1),两组比较有显著性差异(P<0.001)。突破内界膜的内皮细胞数给氧组为58.2±9.9,而对照组小于1,两者比较有显著性差异(P<0.001)。结论高氧可诱导建立小鼠视网膜新生血管模型,其发生与缺氧有关。采用F1TC-Dextran造影铺片是观察视网膜新生血管的有效方法。

氧诱导的血管增生性视网膜病变小鼠模型

目的 建立可量化的血管增生性视网膜病变小鼠模型。方法 将鼠龄为7d的C57BL/6J幼鼠17只暴露于75％氧浓度环境下饲养持续5d,然后回到正常空气中饲养;17只同龄幼鼠置于正常空气环境中饲养作为对照。ADP酶法视网膜铺片了解视网膜血管的改变;用组织切片观察并计数突破视网膜内界膜的内皮细胞核数目;视网膜组织切片用CD31进行免疫组织化学染色。结果 持续高浓度氧使幼鼠视网膜血管收缩、分支闭塞、中央部可见灌注降低,相对低氧使视网膜血管扩张、增生。组织切片可见正常对照组平均每张切片突破内界膜内皮细胞核数目<1个,给氧组平均24个/切片,两组比较差别有显著性意义(P<0.01)。给氧组视网膜组织切片经用CD31抗体处理后显示内界膜玻璃体面细胞染色阳性。结论 该模型具有可重复性强、可定量研究的优点,是进行视网膜新生血管发生机制及药物干预的合适模型。

基于HMGB1/NF-κB/NLRP3轴探讨褪黑素对氧诱导视网膜病变的保护作用

目的观察褪黑素(melatonin,Mel)对新生小鼠氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)的保护作用,并探讨HMGB1/NF-κB/NLRP3轴在其中的作用。方法7日龄C57BL/6J新生小鼠随机分为对照组、模型组(OIR组)及Mel处理组(OIR+Mel组),各组n=9。采用高氧诱导法制备OIR模型。苏木精-伊红染色和视网膜铺片法检测视网膜结构和新生血管;免疫荧光染色法检测HMGB1/NF-κB/NLRP3轴相关蛋白和炎性因子及淋巴细胞抗原6G表达;比色法检测髓过氧化物酶活性。结果OIR组视网膜结构被破坏,出现大片无灌注区和新生血管,OIR+Mel组可见破坏的视网膜结构改善,新生血管和无灌注区减少。与对照组相比,OIR组HMGB1/NF-κB/NLRP3轴相关蛋白和炎性因子表达升高(均P<0.05),淋巴细胞抗原6G表达和髓过氧化物酶活性升高(均P<0.05);Mel处理后,上述各指标降低(均P<0.05)。与对照组相比,OIR组视网膜中褪黑素受体表达降低;Mel处理后,褪黑素受体表达较OIR组升高(均P<0.05)。结论Mel可能通过抑制HMGB1/NF-κB/NLRP3轴减轻OIR新生小鼠视网膜损伤,且可能通过褪黑素受体途径发挥作用。

血小板反应蛋白-1在氧诱导小鼠视网膜病变模型中的表达及意义

目的:检测血小板反应蛋白-1(thrombonspondin-1,TSP-1)在氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型小鼠视网膜中的表达,探讨其在视网膜新生血管中的作用。方法:随机选取7日龄C57BL/6J新生小鼠40只,分为模型组(n=20)及正常对照组(n=20)。模型组小鼠通过高氧诱导的方法建立OIR模型。于小鼠出生后第7,9,11天时两组各随机抽取5只小鼠,取视网膜组织采用RT-PCR法检测TSP-1 mRNA的表达水平;并于小鼠出生后第11天时两组随机取5只小鼠,运用荧光造影视网膜铺片对视网膜新生血管进行形态学观察。结果:出生后第11天时,正常组小鼠视网膜铺片显示视网膜血管分布呈均匀的网状结构,而模型组小鼠视盘周围可见大片无灌注区,视网膜大血管扩张,仅在周边见少量毛细血管分布,为典型的OIR早期表现。出生后第7天,模型组与对照组小鼠视网膜组织中TSP-1 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05);出生后第9天,模型组小鼠视网膜组织中TSP-1 mRNA表达水平下降(P<0.05);出生后第11天模型组小鼠视网膜组织中TSP-1 mRNA表达水平明显低于正常组(P<0.01),且较第9天模型组亦下降(P<0.05)。结论:在新生小鼠OIR模型视网膜血管生长发育抑制期,视网膜组织中TSP-1 mRNA的表达逐渐下降,提示TSP-1可能作为负调节因子在早期参与视网膜新生血管的形成过程。

抗血管内皮生长因子对氧诱导视网膜新生血管病变模型小鼠视网膜多巴胺含量的影响

目的研究抗血管内皮生长因子(VEGF)融合蛋白康柏西普(Conbercept)玻璃体内注射对小鼠氧诱导视网膜新生血管病变(OIR)模型中视网膜多巴胺(DA)含量的影响。方法普通级7 d龄C57BL/6小鼠100只,随机分为空白对照组、OIR组、OIR+生理盐水(NS)组及OIR+Conbercept组,每组25只。其中空白对照组小鼠在常氧环境中饲养至17 d龄。OIR组、OIR+NS组及OIR+Conbercept组小鼠通过高流量吸氧建立OIR模型,并在此环境中饲养至12 d龄,OIR+NS组和OIR+Conbercept组小鼠分别行右眼玻璃体内注射1μL NS、1μL Conbercept后,在常氧环境中饲养至17 d龄,处死。取各组小鼠右眼眼球行HE染色及视网膜铺片,观察突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数及血管分布;行Western blot检测各组小鼠视网膜中酪氨酸羟化酶(TH)、血管内皮生长因子(VEGF)表达量;行高效液相色谱仪检测各组小鼠视网膜DA含量。结果空白对照组小鼠视网膜各层清晰,未见明显无灌注区及新生血管。与空白对照组相比,OIR组小鼠视网膜各层排列紊乱,视盘周围可见大片无灌注区,突破内界膜的血管内皮细胞核数、VEGF相对表达量均增加,TH相对表达量、DA含量均减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05);OIR+NS组与OIR组相比,小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05);与OIR组及OIR+NS组相比,OIR+Conbercept组小鼠视网膜各层排列较清晰,视盘周围可见小片状无灌注区,突破内界膜的内皮细胞核数、DA含量及VEGF、TH相对表达量均减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论OIR模型中视网膜DA含量及TH相对表达量均降低;玻璃体内注射Conbercept后,视网膜新生血管及VEGF相对表达量均减少,TH相对表达量、DA含量均进一步降低。