知母皂甙B-Ⅱ可减少氧-糖剥夺脊髓前角运动神经元瘤细胞的程序性坏死

背景:研究发现知母皂甙B-Ⅱ具有神经保护作用,可减少细胞的程序性坏死,但其作用机制尚不明了,有待深入研究。目的:分析知母皂甙B-Ⅱ干预可减少氧-糖剥夺脊髓前角运动神经元瘤细胞VSC4.1程序性坏死的机制。方法:①取生长状态良好的VSC4.1细胞,分6组培养:A组为正常对照;B组加入过氧化氢溶液干预24 h;C-F组分别加入1,10,100,1 000μmol/L的知母皂甙B-Ⅱ溶液干预24 h,之后各组均加入过氧化氢溶液干预24 h;MTT法检测细胞存活率,选择细胞存活率最高组的药物浓度进行以下实验;②将VSC4.1细胞分3组培养:正常对照组常规培养;模型组厌氧低糖培养8h后复氧高糖培养6或12h;抑制剂组加入程序性坏死抑制剂Necrostatin-1干预24 h,厌氧低糖培养8 h后复氧高糖培养6或12 h。流式细胞仪检测复氧6 h后的坏死细胞数量;Western-blot检测复氧高糖培养6或12 h的受体相互作用蛋白3表达;③将VSC4.1细胞分3组培养:正常对照组常规培养;模型组厌氧低糖培养8 h后复氧高糖培养6 h;药物组加入100μmol/L的知母皂甙B-Ⅱ溶液干预24 h,厌氧低糖培养8 h后复氧高糖培养6 h。流式细胞仪检测复氧6 h后的坏死细胞数量;Western-blot检测复氧6 h的受体相互作用蛋白3表达。结果与结论:①MTT检测显示与B组比较,E组细胞存活率最高,所以后续实验选择100μmol/L的知母皂甙B-Ⅱ;②模型组坏死细胞数多于正常对照组(P <0.05),抑制剂组坏死细胞数少于模型组(P <0.05);抑制剂组复氧高糖培养6,12 h的受体相互作用蛋白3表达高于正常对照组(P <0.05),且复氧6 h的该蛋白表达最高;③模型组坏死细胞数与受体相互作用蛋白3表达均高于正常对照组(P <0.05),药物组坏死细胞数与受体相互作用蛋白3表达均低于模型组(P <0.05);④结果表明,知母皂甙B-Ⅱ可有效减少氧-糖剥夺脊髓前角运动神经元瘤细胞的程序性坏死,可能与降低受体相互作用蛋白3有关系。

miRNA-181b在氧-糖剥夺致N2A细胞缺血损伤中的作用及对热休克蛋白A5表达的调节

目的探讨miR-181b在氧糖剥夺(OGD)致N2As神经瘤细胞缺血损伤中的作用,及其对热休克蛋白(HSP)A5表达的调节。方法应用N2A细胞OGD模型模拟神经细胞缺血损伤,MTT比色法检测N2A细胞生存率,免疫印迹法检测HSPA5蛋白表达水平,实时定量PCR法检测miR-181b和HSPA5 mRNA表达水平,荧光素酶报告基因技术检测miR-181b对HSPA5 mRNA的直接调控作用。结果 miR-181b在OGD致N2A细胞缺血损伤中表达水平明显降低(n=5);在OGD致N2A细胞缺血损伤过程中,通过上调或抑制miR-181b的表达水平可以显著影响N2A细胞的生存率(n=6);而在非OGD条件下,miR-181b表达水平的改变对N2A细胞活力无影响;miR-181b表达水平的改变可显著影响HSPA5蛋白表达水平(n=3),而非HSPA5的mRNA水平;共转染miR-181b前体(premiR-181b)或miR-181b抑制剂(anti-miR-181b)可显著抑制或增高含有HSPA5 mRNA 3’-UTR的荧光素酶报告基因的活性(n=5)。结论 miR-181b通过负性调节HSPA5的蛋白表达水平,在OGD致N2A神经细胞缺血性损伤中发挥重要作用。

miR-378负性调节caspase-3蛋白表达减轻氧-糖剥夺致小鼠N2A细胞缺血损伤

目的探讨miR-378在氧-糖剥夺(OGD)致小鼠成神经瘤N2A细胞缺血损伤中的作用及其可能分子机制研究。方法离体培养N2A细胞,采用3 h OGD/24 h复糖复氧模拟缺血/再灌细胞模型,3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法检测N2A细胞生存率,蛋白印迹(Western blot)检测caspase-3蛋白表达,实时定量RT-PCR检测miR-378和caspase-3 mRNA表达,荧光素酶报告基因验证miR-378对caspase-3 mRNA 3'非翻译区(UTR)的直接调控作用。结果 miR-378在N2A细胞内表达水平,随着3 h OGD复糖复氧时间的增加,而显著降低(P<0.05,n=5);在3 h OGD/24 h复糖复氧致N2A细胞缺血损伤中,上调或下调miR-378的表达水平可显著提高或降低N2A细胞生存率(P<0.05,n=6);而在非OGD条件下,miR-378表达水平改变对N2A细胞生存率则无明显影响;同样,在3 h OGD/24 h复糖复氧条件下,miR-378表达水平的改变可显著影响caspase-3蛋白表达(P<0.05,n=3)而非caspase-3 mRNA表达水平;共转染pri-miR-378可显著抑制含caspase-3 mRNA 3'-UTR的荧光素酶报告基因的表达(P<0.05,n=6)。结论 miR-378可通过负性调节caspase-3蛋白表达水平,来减轻OGD致N2A细胞缺血损伤,所获实验结果有助于从miRNAs水平为缺血性脑卒中提供潜在的治疗靶点。

氧-糖剥夺致皮层神经元一氧化氮的变化及对Caspase-3的影响

目的观察氧-糖剥夺致皮层神经元一氧化氮(NO)的变化及对Caspase-3的影响。方法体外原代培养神经元,选取培养7d的神经元随机分为3组:正常对照组(A组),氧-糖剥夺损伤组(B组),细胞损伤+L-N-硝基精氨酸甲脂(L-NAME)干预组(C组)。采用硝酸还原法检测各组培养液中NO的含量,Western blot检测Caspase-3、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)蛋白表达,半定量RT-PCR检测Caspase-3mRNA表达。结果 B组培养液中NO的含量为(1.77±0.17)μmoL/L,与A组(0.93±0.15)μmoL/L和C组(0.99±0.10)μmol/L比较差异有统计学意义(均P<0.05);同时,B组的Caspase-3蛋白和mRNA表达明显高于A组和C组,B组的NSE蛋白表达明显低于A组和C组。结论氧-糖剥夺可导致皮层神经元NO产生过量,并造成神经元的损伤;L-NAME能减少NO的产生,从而减弱氧-糖剥夺导致皮层神经元损伤。

经典型蛋白激酶Cγ及其相互作用蛋白14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元氧-糖剥夺缺血损伤中的作用

目的探讨经典型蛋白激酶Cγ(cPKCγ)及其相互作用蛋白14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元氧-糖剥夺(OGD)缺血损伤中的作用。方法利用cPKCγ基因敲除(cPKCγ-/-)小鼠和原代培养脑皮层神经元1hOGD/24h复糖复氧(R)模拟离体细胞缺血模型,给予14-3-3γ抑制剂R18干扰,采用免疫共沉淀(Co-IP)、蛋白免疫印迹(Westernblotting)和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,验证cPKCγ与14-3-3γ的相互作用及其对原代培养小鼠脑皮层神经元1hOGD/24hR缺血损伤的影响。结果Co-IP结果证明,14-3-3γ与cPKCγ在小鼠脑皮层中确实存在相互作用;1hOGD/24hR处理使原代培养野生型(cPKCγ+/+)小鼠脑皮层神经元内cPKCγ蛋白水平明显降低,而14-3-3γ蛋白水平显著增加(P<0.05,每组n=6);对于原代培养cPKCγ-/-小鼠脑皮层神经元,尽管14-3-3γ表达水平明显高于cPKCγ+/+小鼠脑皮层神经元,但1hOGD/24hR处理却使14-3-3γ表达水平显著降低(P<0.05,每组n=6),提示cPKCγ可影响神经元内14-3-3γ的表达水平。此外,MTT结果表明,14-3-3γ抑制剂R18(100μmol/L)可显著加重1hOGD/24hR处理原代培养cPKCγ-/-和cPKCγ+/+小鼠脑皮层神经元的缺血损伤(P<0.05,每组n=6)。结论cPKCγ与14-3-3γ在小鼠脑皮层神经元内存在相互作用并影响14-3-3γ的蛋白表达水平,cPKCγ和14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元缺血/低氧损伤中起保护作用。

细胞自噬缓解氧-糖剥夺诱导原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤

目的在离体细胞水平,探讨氧-糖剥夺(OGD)致原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤过程中,细胞自噬的变化情况和可能作用。方法出生24 h内C57BL/6J乳鼠脑皮质神经元原代培养7 d后,分为常氧(Nor.)、15、30、60、90和120 min OGD后24 h复糖复氧等6组,每组n=6;免疫印迹(Western blot)法检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ比值;借助MTT比色法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,检测神经元的损伤;用细胞自噬下游抑制剂巴弗洛霉素A1(Baf A1100 nmol/L)抑制自噬后,观察神经元的损伤。结果与对照组相比,随OGD时间的延长,自噬相关蛋白Beclin-1表达水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,30 min达到峰值,之后略有回降(P<0.05);在OGD处理30和60 min致使神经元显著损伤的基础上,细胞自噬抑制剂Baf A1可明显加重60 min OGD处理神经元的损伤和提高LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(P<0.05)。结论 OGD可诱发原代培养小鼠脑皮质神经元自噬发生,且细胞自噬可缓解OGD处理皮质神经元的缺血损伤。

人参皂苷Rb1对氧-糖剥夺诱导的大鼠原代皮层神经元损伤的保护作用

目的探讨人参皂苷Rb1对氧-糖剥夺诱导的大鼠原代皮层神经元损伤的保护作用。方法神经元置于三气培养箱(85%N2、10%H2、5%CO2混合气体)中用无糖细胞外液中培养1.5 h,构建氧糖剥夺,分为对照组、模型组、人参皂苷Rb1组(0.2、2、20μmol/L)及人参皂苷Rb1(20μmol/L)+LY294002(1μmol/L)组。采用LDH法和PI/FDA双染检测神经元活性和凋亡率,Western blot法检测神经元p-Akt表达。结果与模型组比较,人参皂苷Rb1(2、20μmol/L)可显著降低神经元凋亡率、LDH释放(P<0.05),人参皂苷Rb1(0.2、2、20μmol/L)可显著提高神经元p-Akt表达(P<0.05);与人参皂苷Rb1组(20μmol/L)比较,人参皂苷Rb1+LY294002组可显著逆转人参皂苷Rb1对神经元凋亡、LDH释放的抑制作用,以及对p-Akt表达促进作用(P<0.05)。结论人参皂苷Rb1可经激活PI3K/Akt来减少OGD诱导的大鼠原代皮层神经元凋亡。

右旋美托咪啶对氧-糖剥夺损伤的大鼠海马神经元细胞的保护作用

目的探讨右旋美托咪啶（DEX）在大鼠皮质神经元细胞中对氧-糖剥夺（OGD）损伤的保护作用及其机制。方法取培养8d的原代新生大鼠海马神经元细胞随机分为4组：正常对照组、OGD模型组、DEX对照组和DEX处理组。采用细胞计数试剂盒（CCK-8）比色法检测细胞存活率，高效液相色谱检测细胞外液谷氨酸（Glu）水平，Western blot法检测细胞谷氨酸转运体3（EAACl）蛋白的表达。结果1μmoL／L右旋美托咪啶预处理使神经元OGD损伤后2、12、24h时的细胞存活率分别上升28．6％、57．7％、90．5％（P〈0．05），使OGD引起的Glu过度释放降低53．7％，并上调OGD引起细胞EAAC1蛋白的表达下降（P〈0．05）。结论DEX对大鼠海马神经元OGD损伤具有保护作用，其机制与抑制Glu过度释放、上调EAACl表达相关。

新生大鼠海马神经元体外氧-糖剥夺再灌注模型的建立

目的体外培养新生大鼠海马神经元,建立神经元氧-糖剥夺再灌注(OGD/R)模型,为临床进一步研究新生儿缺氧缺血性脑损伤奠定基础。方法以L-多聚赖氨酸和鼠尾胶原作为海马神经元体外培养的生长基质,分离24h内新生SD大鼠海马,胰蛋白酶水浴振荡消化获得单个细胞,采用Neurobasal维持培养基更继续培养。培养7d后将神经元细胞培养基更换为无糖缺血液,置于95%高纯度氮气(N2)三气培养箱内缺氧处理2h。将其取出更换为正常培养基继续培养24h,构建神经元OGD/R模型。然后,采用抗微管相关蛋白2-5-异硫氰酸荧光素(anti-MAP2-FITC)标记神经元,于荧光显微镜下观察建模前与建模后神经元的形态学改变,采用细胞活性检测试剂盒(CCK-8)检测微管相关蛋白(MAP)2阳性细胞存活率,对OGD/R模型进行评价。结果荧光显微镜下观察到正常情况下神经元细胞形态结构完整,树突及轴突舒展,交织成网状。建模后,神经元突触回缩,细胞崩解,网状结构被破坏。CCK-8检测结果显示,建模后神经元细胞存活率降低。结论此方法体外培养神经元细胞纯度在95%以上;使用无糖神经元细胞缺血液联合高纯度N2培养2h,再更换为正常培养基培养的方法,可成功建立神经元细胞的OGD/R模型。

氧糖剥夺-再灌注星型胶质细胞内皮素-1过表达对神经干/祖细胞增殖的影响

目的探讨氧糖剥夺-再灌注(OGD-R)星型胶质细胞内皮素(ET)-1过表达对神经干/祖细胞(NSPCs)增殖的影响。方法构建阴性对照星型胶质细胞(C6-Mock)和ET-1过表达的星形胶质细胞(C6-ET-1)OGD-R模型,并构建星型胶质细胞与NSPCs Transwell共培养体系。对星型胶质细胞及原代NSPCs进行形态观察及鉴定;将细胞分为以下4组进行共培养:C6-Mock+NSPCs组,OGD-R+C6-Mock+NSPCs组,C6-ET-1+NSPCs组,OGD-R+C6-ET-1+NSPCs组,共培养0、24、48、72 h,分析各组NSPCs神经球直径。结果 C6-Mock及C6-ET-1均呈现Ⅰ型星型胶质细胞的纤维状形态,神经胶质酸性纤维蛋白(GFAP)表达于这两种细胞的胞质中。原代NSPCs的巢蛋白(nestin)染色阳性。共培养后的48 h及72 h,OGD-R+C6-Mock+NSPCs组神经球的直径明显大于C6-Mock+NSPCs组的直径,OGD-R+C6-ET-1+NSPCs组神经球的直径明显大于C6-ET-1+NSPCs组的直径,同时OGD-R+C6-ET-1+NSPCs组神经球的直径明显大于OGD-R+C6-Mock+NSPCs组的直径,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 OGD-R星型胶质细胞促进NSPCs的增殖,且ET-1过表达进一步促进了NSPCs的增殖。

新生大鼠皮层神经元原代培养及糖-氧剥夺损伤模型的建立

目的:建立较为简便的新生大鼠皮层神经元细胞原代培养方法并建立糖-氧剥夺细胞损伤模型。方法取新生的大鼠(24 h)大脑皮层组织,消化后种植在多聚-L-赖氨酸包被的六孔培养皿上,用含10%胎牛血清DEME-HG液种植,4~8 h后换再用含有B27的Neurobasal培养基维持饲养。于不同时间点在倒置相差显微镜下观察形态变化,用免疫组化方法对神经元特异性标记物NSE染色鉴定。选取培养第7 d的神经元随机分为不作处理的对照组和过糖-氧剥夺建立细胞损伤模型组,Western blotting检测NSE蛋白表达。结果2~8 h神经元细胞贴壁,随着时间的延长,形态呈多变,突起逐渐增多,神经元突起间相互接触形成网络,培养7~10 d时神经元胞体最为丰满,通过免疫组化验证证明所分离培养的是神经元细胞。糖-氧剥夺细胞损伤模型组NSE蛋白表达量较对照组 NSE蛋白表达量明显降低。结论该神经元方法简单易行,神经元纯度较高,并成功的建立糖-氧剥夺神经元损伤模型。

人参皂苷Rb3通过抗氧化应激对HT22细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤的保护作用

为了探讨人参皂苷Rb3对氧糖剥夺-复糖复氧(OGD/R)损伤的HT22细胞氧化应激的抑制作用和神经保护作用,本试验将体外培养的HT22细胞随机分为对照组(Control group)、模型组(OGD/R group)、阳性组(EDA group,OGD/R+EDA 100μmol/L)和Rb3组(Rb3 group,OGD/R+Rb32.5、5、10μmol/L);用连二亚硫酸钠(Na_(2)S_(2)O_(4))10 mmol/L合并无糖DMEM培养基进行氧糖剥夺培养2 h,后复糖复氧2 h以建立体外OGD/R模型,在光学显微镜下观察细胞形态;继而用噻唑蓝(MTT)和乳酸脱氢酶(LDH)检测细胞存亡率,并用试剂盒检测氧化应激相关指标。结果显示,与对照组相比,模型组细胞肿胀、突起消失,死亡率极显著升高(P<0.01),氧化应激相关指标活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)水平和丙二醛(MDA)含量极显著增加(P<0.01),抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性极显著下降(P<0.01),细胞色素C(Cyt-C)释放量极显著增加(P<0.01);与模型组相比,Rb3组可显著改善细胞形态,并极显著提高细胞存活率和降低死亡率(P<0.01),氧化应激方面可极显著降低ROS、NO水平和MDA含量(P<0.01),极显著提高抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性(P<0.01),极显著抑制Cyt-C的释放(P<0.01)。结果表明,人参皂苷Rb3对OGD/R诱导的脑缺血再灌注损伤(CIRI)的体外模型具有明显的保护作用,其机制可能与抗氧化应激、抑制Cyt-C的释放以减少内源性凋亡有关。

miR-134在氧-糖缺失神经元损伤中的作用

目的探讨miR-134在乳鼠脑皮层神经元氧-糖缺失(oxygen glucosedeprivation,OGD)致缺血损伤中的作用及其可能分子机制。方法离体培养乳鼠脑皮层神经元10d后,随机分为五组,正常组和OGD组,后者包括非转染组、miR对照组、miR-134抑制剂组、miR-134前体组。按照分组加入饲养液中感染24h换液,72h后对OGD组进行OGD处理。利用噻唑蓝(MTT)法检测神经元生存率,Western blotting检测热休克蛋白A12B(HSPA12B)表达水平,实时定量RT-PCR方法检测miR-134和HSPA12BmRNA表达水平以及通过双荧光素酶报告基因技术验证miR-134对HSPA12BmRNA 3’UTR的直接调控作用。结果与非转染组比较,在OGD致神经元缺血损伤中miR-134前体组,miR-134的表达水平明显提高,细胞存活率明显降低,HSPA12B蛋白水平明显降低,荧光素酶活性也明显降低(P<0.05);而miR-134抑制剂组miR-134的表达水平明显降低,细胞存活率显著提高,HSPA12B蛋白水平明显提高,荧光素酶活性也明显升高(P<0.05);但各组之间HSPA12BmRNA水平差异无统计学意义。结论miR-134通过负性调控HSPA12B蛋白表达水平,在OGD所致神经元缺血损伤中发挥重要作用,在mRNA水平上为治疗缺血性脑卒中提供了可能的分子靶标。

淫羊藿苷对氧糖剥夺PC12细胞活力和细胞形态的影响

目的:观察淫羊藿苷对PC12细胞的毒性作用以及不同给药方法、给药剂量对氧糖剥夺PC12细胞活力的影响。方法:将不同浓度的淫羊藿苷与PC12细胞作用24 h后,用MTT法检测细胞活力。用预给药1 h,氧糖剥夺期间给药2 h,预给药1 h+氧糖剥夺期间给药2 h方法给药,细胞复氧复糖24 h后,用MTT法检测细胞活力,预给药1 h+氧糖剥夺期间给药2 h组在造模结束后用倒置显微镜观察细胞形态。结果:PC12细胞用10^(-8)~10^(-4)mol/L淫羊藿苷孵育24 h后,细胞活力与正常组比较均显著下降(P<0.01);10^(-8)~10^(-5)mol/L淫羊藿苷预给药1 h均使模型细胞的活力显著升高(P<0.01);10^(-8)~10^(-4)mol/L淫羊藿苷氧糖剥夺期间给药2 h均使模型细胞的活力显著下降(P<0.01);10^(-8)~10^(-5)mol/L预给药1 h+氧糖剥夺期间给药2 h均使模型细胞的活力显著升高(P<0.01),使模型细胞数量增加,细胞形态改善。结论:淫羊藿苷与细胞的作用时间不宜过长,预给药1h+氧糖剥夺期间给药2 h对氧糖剥夺-复氧PC12细胞能起到较好的保护作用。

七氟烷逆转氧糖剥夺—复糖复氧诱导的小胶质细胞炎性反应

目的:探讨七氟烷在氧糖剥夺—复糖复氧(OGD/R)所致小胶质细胞炎性反应中的作用及其机制。方法:采用氧糖剥夺4 h、复糖复氧24 h的方法制备小鼠小胶质N9细胞OGD/R模型,给予不同浓度(0、0.5%、1.0%、1.5%)的七氟烷处理N9细胞。将N9细胞随机分为对照组、七氟烷+对照组、OGD/R组、七氟烷+OGD/R组。其中对照组不做任何处理;七氟烷+对照组给予七氟烷处理30 min;OGD/R组给予行氧糖剥夺4h,复糖复氧24 h;七氟烷+OGD/R组在OGD/R组的基础上给予七氟烷处理30 min。采用MTT活性和乳酸脱氢酶(LDH)活性检测确定七氟烷的有效浓度;采用免疫荧光化学法检测小胶质细胞表面分子CD11b表达的水平;Western blotting实验检测NF-κB蛋白的表达的水平;ELISA实验检测炎症因子TNF-α、IL-1β及NO的含量。结果:1.5%七氟烷可减少OGD/R模型诱导的N9细胞LDH的释放(P<0.05),增加N9细胞的活力(P<0.05),降低细胞表面分子CD11b的表达水平(P<0.05),降低NF-κB蛋白的表达的水平(P<0.05),减少炎症因子TNF-α、IL-1β及NO的含量(均P<0.05)。结论:七氟烷可降低OGD/R诱导的小胶质细胞炎性反应,其机制可能与NF-κB信号通路有关。

黄芪甲苷在N-甲基-D-天冬氨酸受体介导的神经元兴奋性损伤中的保护作用

目的探讨黄芪甲苷(astragalosideⅣ)对N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)介导的神经元兴奋性损伤的保护作用。方法选择新生0~1 d的C57/BL6J小鼠,分离海马区神经元进行原代细胞培养,将培养的神经元随机分为对照组、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)损伤模型组、氧-糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)模型组、NMDAR抑制剂氯胺酮组及黄芪甲苷组。采用Hoechst-33342染色观察各组神经元死亡情况,采用ELISA法检测各组神经元乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放情况;采用Ca^(2+)成像观察不同条件下〔加入NMDA;NMDAR抑制剂APV(100μmol/L)预处理+NMDA;黄芪甲苷(100μmol/L)预处理+NMDA;无Ca^(2+)+NMDA〕神经元内钙离子浓度;采用Western blot测定各组神经元活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)的表达。另选择出生后4~6周的C57BL/6雄性小鼠,制备包含海马的冠状脑切片,使用电压钳观察黄芪甲苷应用前后突触后膜电流的变化。结果与应用黄芪甲苷(100μmol/L)前比较,应用黄芪甲苷(100μmol/L)后海马CA1区锥体细胞微小兴奋性突触后电流的平均峰值降低〔(9.96±0.43)pA比(12.63±0.45)pA;t=3.741,P<0.05〕,平均频率〔(0.52±0.03)Hz比(0.68±0.05)Hz;t=2.933,P<0.05〕下降;与NMDA损伤模型组相比,黄芪甲苷组神经元凋亡率降低,LDH释放减少,活化型Caspase-3表达减低,细胞内钙离子内流减轻(均P<0.05);在体外OGD模型实验中,黄芪甲苷亦表现出同样的神经元保护作用。结论黄芪甲苷在NMDAR介导的神经元兴奋性损伤中具有保护作用,其作用机制与抑制NMDAR有关。

神经干细胞联合依达拉奉对氧糖剥夺-再灌注皮层神经元的保护作用及机制探讨

目的探讨神经干细胞联合依达拉奉治疗对氧糖剥夺-再灌注(OGD-R)皮层神经元的保护作用及可能机制。方法(1)体外培养胎龄14~16 d的SD胎鼠脑组织神经干细胞,采用免疫荧光染色检测巢蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白2(MAP2)的表达进行鉴定。原代培养新生24 h内SD大鼠皮层神经元,采用免疫荧光染色检测神经元特异性核蛋白(NeuN)、β-微管蛋白(β-Tubulin)的表达进行鉴定。(2)将原代培养的皮层神经元分为正常组(正常培养)、OGD-R模型组(缺氧处理1.5 h后再复氧培养24 h)、OGD-R+神经干细胞组(缺氧处理1.5 h后再复氧培养时,加入神经干细胞与皮层神经元共培养24 h)、OGD-R+依达拉奉组(缺氧处理前加入100μmol/L依达拉奉,缺氧处理1.5 h后再复氧培养24 h)、OGD-R+神经干细胞组+依达拉奉组(缺氧处理前加入100μmol/L依达拉奉,缺氧处理1.5 h后再复氧培养时,加入神经干细胞与皮层神经元共培养24 h),24 h后采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测各组神经元的增殖,流式细胞仪检测神经元凋亡率,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测神经元上清中白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blotting实验分别检测神经元Notch1、Hes1、Hes5 mRNA及蛋白的表达。结果(1)免疫荧光染色检测结果显示神经干细胞球巢蛋白、GFAP、MAP2阳性,皮层神经元NeuN及β-Tubulin阳性,均鉴定成功。(2)与正常组比较,OGD-R模型组、OGD-R+神经干细胞组、OGD-R+依达拉奉组神经元细胞存活率减低、凋亡率增加、上清中IL-1β及TNF-α含量升高、Notch1 mRNA及蛋白的表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与OGD-R模型组比较,OGD-R+神经干细胞组+依达拉奉组神经元细胞存活率升高、凋亡率减少、上清中IL-1β及TNF-α含量减低、Hes1和Hes5 mRNA及蛋白的表达均降低,OGD-R+依达拉奉组、OGD-R+神经干细胞+依达拉奉组神经元Notch1 mRNA及蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论神经干细胞联合依达拉奉治疗可以逆转OGD-R导致的神经元损伤,可能是通过抑制炎性因子和Notch信号通路上关键信号分子Notch1、Hes1、Hes5的表达来发挥作用。

下调microRNA-181b在小鼠缺血性脑损伤中的神经保护作用

目的:探讨microRNA-181b(miR-181b)在缺血性小鼠脑损伤病理过程中的神经保护作用。方法:应用N2A细胞氧-糖剥夺(OGD)模型模拟神经细胞缺血损伤;应用小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型模拟缺血性脑损伤(成功率约60%),原位细胞凋亡检测试剂盒检测N2A细胞损伤程度,蛋白印迹检测miR-181b靶蛋白自噬蛋白5(Atg5)及caspase-9的变化情况,萤光素酶报告基因技术检测miR-181b对Atg5 mRNA的直接调控作用。结果:在OGD致N2A细胞缺血损伤过程中,通过上调或抑制miR-181b的表达水平可以显著影响N2A细胞的凋亡(P<0.05);miR-181b表达水平的改变可显著影响Atg5蛋白表达水平(P<0.05);共转染miR-181b前体或miR-181b抑制剂可显著抑制或增高含有Atg5 mRNA 3’-UTR的萤光素酶报告基因的活性(P<0.05);MCAO后活化caspase-9的表达显著升高,而miR-181b拮抗剂可使MCAO后剪切的caspase-9表达明显减少(P<0.05)。结论:下调miR-181b可能通过调节Atg5的蛋白表达在缺血性小鼠脑损伤中发挥神经保护作用。

脑缺血/再灌注损伤中产生IL-17A的神经细胞类型鉴定

目的在离体细胞水平鉴定脑缺血/再灌注损伤中产生白细胞介素-17A（IL-17A）的脑固有神经细胞类型。方法利用原代培养小鼠脑皮层神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞1-4 h氧-糖剥夺/24 h复糖复氧（OGD/R）模拟细胞离体缺血/再灌注损伤模型,用免疫荧光双标、实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）等技术,确定产生IL-17A的神经细胞类型。结果三种神经细胞中,除NeuN阳性神经元外,小胶质细胞和星形胶质细胞在OGD/R处理后,均可表达IL-17A蛋白,且分别与其特定标志物Iba-1和GFAP存在共定位现象。星形胶质细胞经过1-6 hOGD/24 h R处理后,IL-17A mRNA表达水平随OGD时间延长显著增高,且在4 hOGD/R时达高峰[（2.74±2.48）,P〈0.001,每组n=5]。此外,OGD/R可促进星形胶质细胞表达IL-17A蛋白[（3.17±0.91）,P〈0.05,每组n=5]。结论脑缺血/再灌注损伤中星形胶质细胞可能是产生IL-17A的主要来源。

间充质干细胞诱导的神经干细胞条件培养基对原代培养海马神经干细胞缺氧损伤的保护作用

目的探讨人胎盘间充质干细胞诱导的神经干细胞条件培养基对氧-糖剥夺后的海马神经干细胞的保护作用。方法建立将人胎盘间充质干细胞诱导成神经干细胞的方法,检测诱导后的神经干细胞的生物学特性;收集诱导的神经干细胞的条件培养基;原代培养小鼠海马神经干细胞并鉴定其神经干细胞相关分子的表达;建立原代海马神经干细胞氧-糖剥夺模型;采用EdU染色比较正常组(Normal组)、氧-糖剥夺组(OGD组)和氧-糖剥夺+条件培养基组(OGD+CM组)神经干细胞的增殖能力;采用免疫荧光染色法检测不同组凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3的表达;采用Western blot法检测不同组SOD蛋白的表达;采用流式细胞术检测不同组ROS水平情况。结果荧光染色结果显示,与Normal组相比,OGD组神经干细胞EdU阳性细胞数减少,Cleaved-Caspase-3阳性细胞数目增加(P均<0.05);与OGD组相比,OGD+CM组神经干细胞的EdU阳性细胞数增多,Cleaved-Caspase-3阳性细胞数目减少(P均<0.05)。Western blot结果显示,与Normal组相比,OGD组SOD蛋白表达下降(P<0.05);与OGD组相比,OGD+CM组SOD蛋白表达升高(P<0.05)。流式细胞术结果显示,与Normal组相比,OGD组ROS表达升高(P<0.05);与OGD组相比,OGD+CM组ROS表达降低(P<0.05)。结论人胎盘间充质干细胞诱导的神经干细胞条件培养基能够提高氧-糖剥夺损伤的海马神经干细胞的增殖能力,减少细胞凋亡并促进细胞内的抗氧化能力恢复。