基于氨单加氧酶基因的自养脱氮菌群结构分析

全程自养脱氮是一种在高氨氮低溶氧条件下完全由自养菌群作用脱除氮素的现象。以全程自养脱氮污泥为研究对象,特异性扩增氨单加氧酶活性基因amoA片段,建立克隆文库并对克隆序列进行系统发育学分析,考察全程自养脱氮系统从建立到退化过程中氨氧化菌的结构变迁。结果表明:Nitrosomonas oligotropha和Nitrosomonas europaea细菌是系统中的主要氨氧化菌,而随着系统的退化前者逐渐被后者完全取代,而氨氧化菌的种群变迁可能并不是全混流系统全程自养脱氮效率下降的原因。

滇池沉积物中好氧氨氧化细菌群落多样性研究

从滇池沉积物中提取好氧氨氧化细菌(aerobic ammonium-oxidizing bacteria,AOB)的DNA,通过构建硝化作用氨单加氧酶基因(amo A)文库并划分操作分类单元(OTU)的方法,揭示好氧氨氧化细菌群落结构多样性。获得了80个amo A基因克隆,利用Mothur软件将相似度不小于97%的序列归为1个OTU,共得到22个OTUs,其中OTU1、OTU2、OTU3单元最大,分别包含了27、12、9条序列。对22个OTUs的代表序列进行系统发育分析表明,其序列都属于变形杆菌的β-亚纲,分布于亚硝化螺菌属、亚硝化弧菌属、亚硝化单胞菌属、亚硝化叶菌属4个属;优势种群为Nitrosomonas europaea的近缘种,尚未被描述过。

一株氨氧化菌的分离鉴定及其活性影响因子分析

从浙江舟山南美白对虾养殖池塘底泥样品中筛选到一株具有氨氧化功能的细菌,命名为AOB-1.菌株AOB-1好氧,革兰氏阴性,球状至短杆状;菌落呈淡黄色、干燥、针尖状.16S rDNA序列分析表明,该菌株与Nitrosomonas eutropha C91T的相似性为100%.氨氧化的关键酶--氨单加氧酶的基因(amoA)序列比对表明,该菌株与N.eutropha C91T的相似性为98%.在30℃,100r·min-1时,25～200mL培养基装量范围内装液量越少氨氧化率越高,最适pH值为8.氨氮浓度在1～200mg·L-1范围内,氨氧化速率随氨浓度的升高而加快;在200～1200mg·L-1范围内,氨氧化速率基本保持不变;但当氨氮浓度高达2000mg·L-1时,氨氧化活性受到明显抑制.菌株AOB-1不仅对养殖水体,而且对高浓度氨氮废水的处理也具有潜在的应用价值.

转iaaM基因高衣分棉花新种质材料创制

通过配制9个杂交组合,将iaaM基因转育到综合性状较优的棉花（Gossypium hirsutum L.）品系中.对F1与F2的分析,证实iaaM基因能够显著改良衣分和马克隆值,同时对子指、铃重、单株结铃数等产量性状和纤维长度、纤维强度等纤维品质未造成负面影响.通过系谱法选育获得6个衣分高、马克隆值优良的新品系,其衣分和马克隆值分别在43.23％～47.93％和3.76～4.20.试验为棉花育种改良提供了新的种质材料.

植物生长素合成酶iaaM基因在烟草韧皮部的特异表达对其发育的影响

为探讨生长素过度合成对植物韧皮部发育的影响,利用韧皮部特异表达的拟南芥蔗糖合成酶基因启动子与色氨酸单加氧酶基因(iaaM)重组,构建载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法将其转入烟草,获得了转化的烟草植株。大多转基因烟草都表现出叶片卷曲、植株生长异常的生长素过度表型。转基因烟草植株生长较野生型烟草(对照)植株明显迟缓,但其茎横切面韧皮部细胞显著增多,排列更加紧密整齐,木质部也较早开始分化。转基因烟草茎段有大量不定根分化,其根部则在韧皮部薄壁细胞处诱生大量根原基,在不定根上有大量侧根和根毛的分化。

转iaaM高衣分棉花种质IF1-1杂种优势分析及育种应用

转iaa M(色氨酸单加氧酶基因)高衣分棉花种质已经培育出来,但应用于育种研究较少。我们利用转iaa M高衣分棉花种质IF1-1做父本、16个陆地棉品种(系)做母本,分别配制杂交组合,检测了亲本及其F1和F2群体的iaa M遗传;田间调查了材料的抗病性及农艺性状,室内考查了产量构成因子,同时进行了产量统计分析;通过系统选育结合分子辅助选择对杂交后代进行定向培育,获得了新的高衣分种质,实现了该种质的育种应用。结果表明:(1)FBP7-iaa M是1对显性基因;(2)与高衣分亲本IF1-1相比,F1和F2代衣分不具备超中与超亲优势,但与16个母本品种(系)相比,却能明显提高现有品种(系)的衣分率;(3)F1代产量尤其是皮棉产量具备较明显的超亲优势,皮棉产量优势值为13.4%,这就意味着可以选择生产上产量较高的品种与IF1-1配制杂交组合,选择高优势杂交种直接利用;(4)F1和F2代抗病性明显好于IF1-1,但与母本相比较差,所以,在杂交后代的选择中应注意观察枯萎病和黄萎病的发病情况,选择抗病性好的后代;(5)子棉产量的提高主要是通过铃重和单株铃数的增加来实现,皮棉产量的增加则是通过子棉产量与衣分的共同提高来完成;(6)杂交后代具备选择出高衣分新品系的潜力。本研究实现了将国家科技重大专项获得的第2代转基因棉花种质应用于棉花育种,对提升我国生物育种水平具有重大意义。

海洋异养硝化菌株的快速筛选

目前尚缺乏有效地系统分离获得异养硝化菌的方法,为此,利用海洋养殖废水,采用前期自养后期异养的混养富集方法,获得具有异养脱氮能力的菌群.通过异养培养基分离获得纯菌株,利用特异性引物扩增分离菌株的氨单加氧酶(AMO)基因amoA和周质硝酸盐还原酶(NAR)亚基基因napA,快速筛选具有潜在异养硝化或异养硝化好氧反硝化能力的菌株.通过氮素转化试验确认菌株的氮代谢特性.共分离获得异养细菌22株,其中11株细菌amoA基因呈阳性,7株细菌amoA基因和napA基因同时显阳性,氮素转化试验证明9株细菌具有异养脱氮能力.

烟草和拟南芥表皮毛中特异表达iaaM后的遗传效应

利用色氨酸单加氧酶基因iaaM与拟南芥表皮毛特异表达GL2基因启动子重组后,构建了在植物表皮毛细胞中特异表达iaaM基因的重组基因载体;采用根癌农杆菌叶盘转化法将重组基因转化到烟草WS38(对照)中,筛选和鉴定出了6株转化烟草植株;将该重组基因以根癌农杆菌花序浸渍法转至拟南芥(Colombia ecotype,对照),筛选出9株拟南芥转化植株,并对稳定转化的转基因植株表皮毛进行观察。结果表明:转基因烟草表皮毛较对照植株显著增长,其长度最长为对照的2.2倍,但转基因拟南芥表皮毛长度与对照间无显著差异。对烟草幼叶进行生长素浓度检测,转iaaM基因烟草吲哚乙酸含量显著提高,说明iaaM在烟草表皮毛细胞中表达,使其合成和积累更多的生长素;转基因拟南芥和烟草表皮毛密度均较对照显著增加,证明植物表皮毛发育模式中GL2表达的特异性受细胞内生长素的影响。

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007吲哚-3-乙酰胺IAA合成功能及其依赖途径鉴定

【目的】探索吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007(Burkholderia pyrrocinia JK-SH007)合成生长素吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)的能力,并阐明B.pyrrocinia JK-SH007存在色氨酸依赖型的吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide, IAM)IAA合成途径。【方法】使用Salkowski比色法和酶联免疫吸附法(ELISA)进行L-色氨酸对B.pyrrocinia JK-SH007合成IAA能力影响的检测;以B.pyrrocinia JK-SH007全基因组为模板,设计特异性引物克隆iaaM和iaaH基因,并使用生物信息学方法对其蛋白质和亲缘关系进行分析;通过实时荧光定量PCR方法分析B.pyrrocinia JK-SH007中的iaaM和iaaH基因在L-色氨酸处理下的差异表达。【结果】B.pyrrocinia JK-SH007菌株能够合成15.663μg·mL-1的IAA,在以L-色氨酸为前体的条件下其合成IAA的量显著增加,达到了44.404μg·mL-1。iaaM和iaaH基因均含有一个完整的开放阅读框,其中iaaM基因全长1 782 bp,编码593个氨基酸,属于Aminooxidase super family家族;iaaH基因全长1 368 bp,编码455个氨基酸,属于Amidase super family家族。在L-色氨酸的处理下,B.pyrrocinia JK-SH007中的iaaM和iaaH基因的表达量均显著增加。【结论】B.pyrrocinia JK-SH007具有合成IAA的能力,L-色氨酸对其合成IAA具有显著促进作用,且克隆得到了iaaM和iaaH基因,其在进化上具有一定的保守性,证明B.pyrrocinia JK-SH007中存在吲哚-3-乙酰胺IAA合成途径。

氨氧化古菌及其对氮循环贡献的研究进展

硝化作用先将氨氮氧化为亚硝酸盐氮并进一步氧化为硝酸盐氮,这一过程是氮进行全球生物化学循环的重要环节。随着氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)基因组序列中氨单加氧酶编码基因(amo A)的发现以及AOA在实验室条件下的成功培养(包括分离纯化和富集培养),基于分子生物学的研究表明AOA在各种环境广泛存在,且多数生境中它的数量远远超过氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)。AOA相对于AOB在氮循环中的贡献也引起了多方面的论证和争论。本文就氨氧化古菌的生态分布、系统进化、生境存在丰度及参与硝化作用等进行综述,指出不同生境AOA的活性及其对氮循环的重要性仍需做进一步的研究。

氨氧化古核生物

氨氧化古核生物(AOA)是新为人们所知的氨氧化微生物。AOA的生理特征、生态分布,以及在不同生境中与氨氧化细菌(AOB)的比较等研究,显示了他们在自然环境中有着数量大,分布广,种类多等特征。本文对近年来AOA的研究现状、争论、前景和应用进行了综述。

纳帕海高原湿地氨氧化微生物群落结构及多样性研究

由微生物主导的氨氧化作用是硝化过程的限速步骤,同时也是氮素循环过程中的关键步骤.本研究基于氨单加氧酶基因(amoA),对纳帕海高原湿地旱季的沼泽土(DS. YN1)、沼泽化草甸土(DS. SD1)和泥炭土(DS. NT1)中氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)群落多样性、系统发育和丰度及其与土壤理化因子的响应机制进行了初步研究.结果表明,AOA amoA基因克隆文库在DS. SD1中多样性最高,AOB amoA基因克隆文库在DS. YN1中多样性最高.系统发育分析表明,AOA菌群主要来自Thaumarchaeota Group1. 1a;,AOB菌群主要来自Nitrosomonas和Nitros-opira. AOA amoA基因拷贝数达104～105copies/g,AOB amoA基因拷贝数达105copies/g,仅DS.NT1采样区中AOA amoA基因拷贝数高于AOB amoA.理化因子相关性分析表明,在DS. YN1采样区中,AOA和AOB群落组成受p H和氨态氮(NH4+-N)影响较为显著;在DS. NT1采样区中,AOA和AOB群落组成受亚硝态氮(NO2--N)的影响较为显著. Pearson相关性表明,仅AOBamoA基因拷贝数与土壤理化因子具有显著相关性.本研究初步阐明AOA和AOB在纳帕海高原湿地氨氧化过程中的作用及其对土壤理化因子变化的响应机制,进一步为研究该高原湿地氮素循环奠定理论基础.

长江口邻近海域沉积物中好氧氨氧化细菌群落多样性

从长江口邻近海域沉积物中提取好氧氨氧化细菌(aerobic ammonium-oxidizing bacteria,AOB)的DNA,通过构建硝化作用氨单加氧酶基因文库并划分操作分类单元(OTU)的方法,揭示好氧氨氧化细菌群落结构多样性。结果显示,研究的两个站位(G6站和33站)分别获得417和428个amoA基因克隆,其序列皆属于变形杆菌的β-亚纲,但与此亚纲中已有明确分类信息菌株的amoA基因序列距离较远,相似度较低;利用DOTUR软件将相似度不小于97%的序列归为一个OTU,两站均得到11个OTUs,但离岸较近的G6站沉积物中β-AOB具有较高的多样性,而离岸较远的33站则多样性较低,且两个站位中的优势类群差异明显。

季节性河流好氧氨氧化微生物的时空分布及网络互作研究——以漕河为例

好氧氨氧化是硝化过程的关键步骤,第3种好氧氨氧化微生物—完全氨氧化细菌(Complete Ammonia Oxidizer,Comammox)的发现进一步完善了人们对硝化过程的认识.Comammox被发现广泛分布于自然和人工生态系统,但其在季节性河流的时空分布及生态网络互作关系的研究较少.本研究应用实时荧光定量q PCR、宏基因组测序和氨单加氧酶功能基因(amo A)特异性分析等方法,探究了不同水文时期漕河岸边带和开阔水体表层沉积物中Comammox等好氧氨氧化微生物的丰度、分布、群落结构、共生模式及关键环境因子.结果表明,Comammox的amo A基因丰度(106~108copies·g-1)最高,显著高于氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing Archaea,AOA)和氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing Bacteria,AOB),与宏基因组分析得到相对丰度结果一致.Spearman相关性和冗余分析表明,含水率(Moisture content)是Comammox等好氧氨氧化微生物丰度的关键影响因子.生物多样性和主坐标分析(Principle Coordinate Analysis,PCo A)表明,Comammox等好氧氨氧化微生物的群落结构具有明显的时间异质性,其α多样性在丰水期高于枯水期.季节性河流沉积物中Comammox菌主要为Nitrospira sp.SCGC AG-212-E16,相对丰度可达21.4%±6.4%;其次为Nitrospira sp.SG-bin-1、Candidatus Nitrospira nitrificans和Candidatus Nitrospira nirosa.结合分子生态网络分析进一步发现,Nitrospira sp.SCGC AG-212-E16是Comammox群落的关键菌种,起主要的群落内部连接功能.本研究揭示了Comammox细菌在河流生态系统中的高丰度和时空异质性,对进一步研究Comammox等好氧氨氧化微生物在硝化过程中的贡献以及河流氮污染的治理具有重要意义.

白洋淀流域岸边带土壤全程氨氧化菌的分布特征及其生态网络研究

氨氧化途径一直被认为是硝化过程的限速步骤.新型氨氧化微生物—全程氨氧化菌(Complete Ammonia O_(x)idizer,Comammox)的出现更新了人们的认识.虽然全程氨氧化过程已被发现于多种自然生态系统,但其在水位波动环境,尤其是工程引水的岸边带系统,尚缺乏报道.采用宏基因测序技术及氮循环基因特异性分析,研究南水北调典型受水区Comammox的时空特征和潜在生态网络关系.结果表明,在白洋淀流域尺度,入淀河流岸边带系统中,Comammox相对丰度具有明显的时空分布特征.时间尺度上,Comammox相对丰度在枯水期(1455 TPM)显著高于丰水期(1115 TPM);空间尺度上,Comammox在上游山区丰度最高(1403 TPM),显著高于中游(山区/平原生态过渡区;515 TPM)和下游平原区(653 TPM).Spearman相关性分析结果表明,MC对Comammox相对丰度具有显著影响(p<0.05).与其他好氧氨氧化微生物相比,Comammox相对丰度显著高于氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing Bacteria,AOB),却低于氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing Archaea,AOA).其中,AOB与Comammox时空分布规律相似,而AOA与Comammox仅在时间上分布规律一致.通过构建分子生态网络分析,发现在中游山区/平原过渡区,好氧氨氧化微生物具有最高模块化水平,其中,Comammox是关键物种,Nitrospira nitrificans是关键群落连接者.本研究结果将为我们认识生态补水背景下河流氨氧化过程时空演替和功能趋势提供理论依据.

典型对虾养殖水体中参与硝化与反硝化过程的微生物群落结构

【目的】本研究旨在分析典型虾塘养殖水体中参与氮循环关键过程的菌群多样性,为指导实际对虾养殖水体中NH 4+和NO 2-的微生物降解、水体氮素污染控制以及虾塘养殖氮素循环的有效管理提供科学依据。【方法】使用聚合酶链式反应及变性梯度凝胶电泳技术(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient GelElectrophoresis,PCR-DGGE)从8个不同地点的虾塘水样中确定代表性水样,以此为典型水样进行研究,构建了氨单加氧酶基因(amoA)、亚硝酸盐氧化还原酶基因(nxrA)、亚硝酸盐还原酶基因(nirS)的克隆文库。利用限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)技术将克隆文库进行酶切分析。【结果】通过序列多态性分析,表明amoA基因克隆文库中所有序列都属于变形杆菌门β亚纲(β-Proteobacteria),分别为亚硝化单细胞菌属(Nitrosomonas)(81%)和亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)(19%)2个属。nxrA基因克隆文库检测到α-Proteobacteria和δ-Proteobacteria两个亚纲,其中硝化杆菌属(Nitrobacter)是优势菌群,占整个文库的92%,仅有一个类群属于δ亚纲的脱硫杆菌科(Desulfobacteraceae)(8%)。nirS基因文库群落结构相对于amoA和nxrA基因文库较复杂,分别为α-Proteobacteria、β-Proteobacteria亚纲和Actinobacteria,序列分析表明,25%的类群为固氮弧菌属(Azoarcus),25%的类群为(Polymorphum),20%的类群为需氧去氮菌属(Thauera),10%的类群为(Sophophora),10%的的类群为链霉菌属(Streptomyces),5%的类群为(Brachymonas),5%的类群为(Ruegeria)。【结论】典型虾塘养殖水环境中氮素循环关键过程的菌群多样性丰富,其中亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和硝化杆菌属(Nitrobacter)分别是此环境中主要的氨氧化作用推动者和亚硝酸盐氧化作用推动者,而在反硝化重要环节中,固氮弧菌属等多种菌群都起着推动作用。

内循环半短程亚硝化工艺运行条件与微生物群落研究

在内循环半短程亚硝化工艺中，污泥浓度为4000mg·L^-1、溶解氧小于0．2mg·L^-1、温度（15～29℃）、水力停留时间4．6h条件下，不同的回流比对系统中微生物群落有着明显的影响，回流比75％时，微生物的生物量达到最高值，出水中的亚硝态氮和氨氮的浓度比可控制在1．定量PCR和16SrRNA基因的克隆文库结果表明：在低溶解氧浓度下氨氧化菌是主要脱氮菌群，该菌群促进了半短程亚硝化反应的进行，与传统的硝化系统比较，在内循环半短程亚硝化工艺中没有检测到硝化螺旋菌（Nitrospira）和硝化杆菌（Nitrobacter），在内循环半短程亚硝化系统中浮霉菌属（Planctomycetes）的量也高于传统的脱氮系统．氨单加氧酶基因克隆文库结果表明，系统中的氨氧化菌群主要属于亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）．因此内循环半短程亚硝化工艺在经济和技术上是可行的．