基于氨单加氧酶基因的自养脱氮菌群结构分析

全程自养脱氮是一种在高氨氮低溶氧条件下完全由自养菌群作用脱除氮素的现象。以全程自养脱氮污泥为研究对象,特异性扩增氨单加氧酶活性基因amoA片段,建立克隆文库并对克隆序列进行系统发育学分析,考察全程自养脱氮系统从建立到退化过程中氨氧化菌的结构变迁。结果表明:Nitrosomonas oligotropha和Nitrosomonas europaea细菌是系统中的主要氨氧化菌,而随着系统的退化前者逐渐被后者完全取代,而氨氧化菌的种群变迁可能并不是全混流系统全程自养脱氮效率下降的原因。

中华根瘤菌NP1氨单加氧酶基因的克隆与功能鉴定

以中华根瘤菌NP1(Sinorhizobium sp.NP1)为原始菌株,通过同源克隆与Tail-PCR方法,获得1089bp的氨单加氧酶基因(amo)全长序列.该基因编码362个氨基酸,其二级结构与Sinorhizobium meliloti1021AMO的二级结构相似,该蛋白有9个跨膜区段.以自杀穿梭质粒pJQ200SK为原始载体,构建NP1amo基因敲除质粒pJQ200SK-amo-Tc.采用三亲本杂交的方法将该质粒转入原始菌株NP1中,获得amo基因敲除菌株NP1∷amo.通过本贝洛氏(Berthelot)法对氨氮进行测定,发现NP1∷amo的脱氮效率比原始菌株NP1下降约35%.该结果表明,本实验中所克隆的氨单加氧酶基因为脱氮关键酶基因.

三种农田土壤中氨氧化细菌amoA基因多样性比较分析

比较分析中国东部不同季风气候区中海伦黑土(HL)、封丘潮土(FQ)和鹰潭红壤(YT)3种土壤氨氧化细菌amoA基因多样性。采用非培养方法直接从土壤中提取微生物总DNA,用氨氧化细菌amoA基因特异引物扩增总DNA,构建了3种土壤amoA基因文库,并对文库进行限制性长度多态性(RFLP)分析。HL、FQ和YT的amoA基因文库克隆数量分别为49、50和48个,相应的RFLP类型数为10、10和14个OTUs,其中有4个OTUs为三种土壤共有;YT中氨氧化细菌amoA基因多样性指数最高,FQ最低;HL和FQ群落的相似为70%,HL与YT的相似度为50%,而FQ和YT之间仅为42%,说明氨氧化细菌具有地理分布的规律:17个amoA基因序列可以被聚成6个cluster,分属Nitrosospira和Nitrosomonas两个属。三种农田土壤中均存在丰富的氨氧化细菌,表明氨氧化细菌在农田土壤氮素循环中具有重要作用。

古菌氨氧化与amoA基因的扩增

氨氧化过程是由变形菌纲中的一小部分细菌类群所进行的专性好氧的化能自养过程,氨氧化细菌(AOB)是硝化反应中负责将NH4+转化为NO2-的一类无机自养微生物,氨氧化古菌(AOA)是独立于AOB进化枝之外的能进行氨氧化作用的古菌。介绍了AOA古菌的发现过程及其氨氧化作用,提取、纯化了amoA基因并利用amoA基因的特征,对它进行扩增,证实了AOA古菌的存在,并为后续研究提供了依据。

硝化池中氨氧化细菌amoA基因的检测及其多样性研究

为了分析污水处理系统中氨氧化细菌的种群组成 ,筛选合成了一对对氨氧化细菌氨单加氧酶基因 (amo A )特异结合的引物序列 ,利用 PCR技术对从活性污泥中抽提的细菌总 DNA进行扩增 ,得到不同重组子的 amo A序列片段 .运用 BL AST程序将测序结果与基因库中的公开序列进行比较 ,发现在该污水处理系统中分布有大量亚硝化单胞菌属 (N itrosomonas)细菌 ,其中最主要的是欧洲亚硝化单胞菌 (N itrosomonas europaea) ,由此推测N

氮源添加对重金属污染土壤氨氧化微生物的影响

矿业活动导致矿区土壤养分流失、土地退化,土壤生态系统敏感且脆弱,恢复过程复杂。其中土壤氮素缺乏是限制该生态系统恢复的主要因子之一。为探讨矿区土壤氮素恢复机制,以广西柳州泗顶矿区重金属污染土壤为研究对象,通过土壤培养实验,采用高通量测序结合荧光定量PCR技术,系统研究了氯化铵(38.114 g∙m^(-1)∙a^(-1)(高浓度)、9.54 g∙m^(-1)∙a^(-1)(低浓度))和尿素(21.43 g∙m^(-1)∙a^(-1)(高浓度)、5.36 g∙m^(-1)∙a^(-1)(低浓度))在不同添加频次(添加12次∙年-1(高频率)和2次∙年-1(低频率))下,对土壤氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)丰度、多样性和群落组成的影响。结果表明,各施氮模式下,amoA-AOB基因丰度显著高于amoA-AOA基因丰度,其丰度范围为(1.56×10^(7)±0.01×10^(7))-(3.58×10^(7)±0.03×10^(7))copies·g^(-1)(氯化铵)和(5.31×10^(7)±0.02×10^(7))-(14.85×10^(7)±0.04×10^(7))copies·g^(-1)(尿素)。AOA群落的ACE、Shannon和Simpson指数均值分别是AOB群落的13.2、1.41和0.627倍,AOA的α-多样性更容易受到不同施氮处理的影响。AOA在门水平上的优势菌门为奇古菌门(Thaumarchaeota)和泉古菌门(Crenarchaeota);在属水平上的优势菌属为亚硝基球菌属(Nitrososphaera)。AOB在门水平上的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria);在属水平上的优势菌属为亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)。相关性分析表明土壤有效磷是影响amoA-AOB基因丰度的关键因素(p<0.01)。冗余分析表明,微生物量氮是引起AOA群落组成改变的主要因子;而土壤脲酶活性是引起AOB群落组成改变的主要因子。添加氯化铵和尿素使土壤氨氧化潜势和总硝化潜势增加,分别是对照的1.15-3.03倍和2.15-8.55倍,AOB主导土壤中的氨氧化和硝化过程。研究为明确矿区土壤氮循环变化规律,重建矿区土壤氮库提供了理论依据。

土壤氨氧化古菌适应酸性胁迫的ATP酶基因分子进化研究

氨氧化古菌(Ammonia-oxidizingarchaea,AOA)被认为是酸性土壤硝化过程的主要微生物类群,但AOA如何适应酸性胁迫并发挥作用一直是研究难点,而ATP酶(ATPase)是能量代谢的关键,其编码基因可能在AOA适应酸性胁迫过程中发生了趋同性演化。据此,本研究针对5个不同种植年限的马尾松人工林酸性土壤(15 a、24 a、45 a、55 a、63 a),通过深度宏基因组测序获得7360亿碱基对,重构AOA氨单加氧酶amo A基因和ATP酶A亚基(ATPase subunit A)基因的系统发育进化谱系,研究AOA适酸的分子机制。结果表明:根据经典的amo A基因系统发育进化分类,所有5个森林土壤中优势AOA主要包括Nitrososphaerales和Ca.Nitrosotaleales两大类群,但Nitrososphaerales类群与中碱性土壤中的AOA古菌亲缘关系更近,与嗜酸的Ca.Nitrosotaleales类群亲缘关系较远,表明amo A基因的系统进化关系不能解释Nitrososphaerales在酸性土壤中的成功定殖。然而,基于ATPase subunit A基因的系统进化分析则发现,所有酸性森林土壤中嗜酸/耐酸氨氧化古菌均含有亲缘关系较近的V-ATPasesubunitA基因,表明氨氧化古菌可能通过基因水平转移获得V-ATPase基因适应酸性胁迫环境,较好地解释了氨氧化古菌适应酸性胁迫的生境扩展规律。随林龄的增加,Ca.Nitrosotaleales类群丰度先减少后增加,而Nitrososphaerales类群丰度先增加后减少,速效钾是显著影响AOA群落结构的重要环境因子。这些结果表明,不同种植年限下酸性人工林土壤中氨氧化古菌种群发生了明显的分化,V-ATPase基因水平转移可能是氨氧化古菌适应酸性胁迫的重要机制。

基于宏基因组学的酸性森林土壤氨氧化微生物群落特征研究

全球30%以上陆地面积是酸性土壤(pH<5.5),而酸性土壤中氨氧化微生物群落特征研究是破译其硝化过程微生物学机理的基础。尤其随着完全硝化微生物(Complete ammonia oxidizer,comammox)的发现,亟需重新认知酸性土壤中氨氧化微生物类群。以酸性马尾松林为研究对象,综合利用荧光定量PCR(qPCR)、凝胶电泳半定量和宏基因组测序等技术研究土壤中氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)、氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和Comammox的相对丰度以及群落组成特征。研究发现AOA和AOB amoA基因丰度分别为2.61×10^(6) copies·g^(-1)和1.45×10^(6)copies·g^(-1);而comammoxamoA基因qPCR结果存在显著的非特异性扩增,导致其丰度被高估,而经凝胶电泳半定量矫正后,约为(1.38~1.47)×10^(6)copies·g^(-1),该结果和土壤宏基因测序揭示的comammox相对丰度基本吻合。此外,宏基因组分析发现经典嗜酸group1.1a-associated仅占AOA总类群的12%,而group1.1b则占88%,尽管目前仍未有嗜酸group 1.1b AOA纯菌株的报道。AOB主要类群为Nitrosospira(约64%),而Nitrosomonas约占36%。Comammox主要类群为clade B(约64%),而clade A仅占36%且均隶属于clade A.1亚枝,这暗示clade B与已报道的嗜中性comammox clade A纯菌株有极大的生理代谢差异。总之,本研究提供了综合利用qPCR、半定量和宏基因组分析土壤氨氧化微生物群落的策略,并建议优化comammox的qPCR引物,同时本研究系统分析了酸性马尾松林土壤中氨氧化微生物的相对丰度和群落组成特征。

苯丙氨酸羟化酶基因突变检测对苯丙酮尿症的诊断意义

目的:探讨苯丙氨酸(PA)羟化酶(PAH)基因突变检测对苯丙酮尿症(PKU)的诊断意义及其对PKU患儿的影响。方法:选取PKU患儿135例进行临床实验,所有受试者PAH基因突变情况均采用聚合酶链式反应技术进行扩增,采用Sanger测序方法检测其突变点,PAH基因是否存在大片缺失重复采用多重连接探针扩增技术(MLPA)检测,最后将各项检测数据纳入SPSS 21.0软件处理,分析PAH突变情况及比较其PAH突变对KPU患儿智商的影响。结果:135例PKU患儿(270对PAH等位基因)中,共12例患儿有PAH基因突变,占比8.89%,突变位点共12个,其中R243Q、Y204C、R241C、IVS4-1、R413P、R111X、R261Q、W326X及Y356X等均有突变频率,各占总PAH等位基因的5.19%、5.19%、3.70%、2.96%、2.22%、1.48%和1.48%、0.74%、0.74%,而E56D、F161S、A345T等的突变频率则不明显。经SNaPShot、Sanger及MLPA检测12例PKU患儿的PAH基因突变情况发现,纯合突变占比16.67%,复合、杂合突变占比83.33%。12例PKU患儿干预后的PA低于干预前、全智商评分高于干预前,差异均具有统计学意义(P<0.05),而言语智商、操作智商干预前后差异均无统计学意义(P>0.05)。经Pearson分析发现12例PAH基因突变的PKU患儿治疗期的PHE平均控制浓度与1周岁时的IQ检测值呈负相关(r=-0.924,P<0.01)。结论:在PKU患儿的临床治疗过程中科学、合理地进行PAH基因突变检测并严格控制患儿的PHE血浓度有较好的临床应用与推广价值,也是改善患儿智商的关键因素之一。

土地利用类型对土壤氨氧化微生物丰度和群落结构的影响

氨氧化是硝化作用的限速步骤,在土壤氮素循环中起着重要作用。目前关于土地利用驱动的土壤理化性质变化对氨氧化微生物影响的相关研究较为匮乏。本试验选取林地、农田和设施蔬菜地3种利用方式土壤,基于荧光定量PCR和Illumina Miseq高通量测序技术,研究了不同土地利用类型土壤中氨氧化古菌(AOA)、氨氧化细菌(AOB)的丰度和群落结构。结果表明:林地AOA丰度显著高于农田和设施蔬菜地,农田AOB丰度显著高于设施蔬菜地和林地,林地AOB丰度最低。农田土壤AOA和AOB的Shannon指数均最高,设施蔬菜地AOA的Shannon指数最低。设施蔬菜地AOA的ACE指数和Chao1指数显著低于林地和农田。林地和农田AOA的主要优势类群是泉古菌门,奇古菌门在设施蔬菜地中为主要优势类群。AOB的变形菌门在林地和农田中为主要优势类群,在设施蔬菜地中仅占23.10%。土壤pH值、全氮和铵态氮含量显著影响AOA的群落结构,土壤pH值和有机碳含量是导致AOB群落结构变化的主要影响因素。以上结果表明,不同干扰程度的土地利用类型,通过影响土壤的理化性质改变AOA和AOB的群落分布。

夏季珠江口冲淡水对氨氧化古菌的空间演替及分布规律的影响

氮在海洋生物地球化学循环中起着重要的作用,通常能限制海洋生物的生产力.硝化反应是氮循环的核心环节,且氨氧化反应是硝化作用的限速步骤,再加上氨氧化古菌(Ammonia Oxidizing Archaea,AOA)是氨氧化反应的主力军,因此海洋氨氧化古菌成了研究热点.通过对夏季珠江口的不同深度水体进行研究,以氨氧化古菌的功能基因氨单加氧酶(amoA)作为分子标记,运用454高通量测序技术和定量PCR在DNA和cDNA水平上来分析氨氧化古菌的群落结构组成、多样性和基因丰度分布特征.结果表明,夏季珠江口的淡水来源站位(A2B)有着最高的氨氧化古菌群落多样性,但丰度最低;自由生活型的氨氧化古菌丰度是附着生活型的10~1000倍,这可能是氨氧化古菌的主要生存策略;盐度是影响夏季珠江口氨氧化古菌群落结构组成的主要环境因子,而其amoA基因丰度与环境因子之间没有显著性差异;表层和底层AOA群落之间的差异较自由生活的与附着的群落之间更为明显.研究表明在cDNA水平上对功能微生物类群进行探究的必要性,有助于增进水体氨氧化古菌群落响应环境变迁的认识.

氨氧化细菌的分子生态学研究进展

氨氧化细菌(AOB)在全球氮循环中具有重要作用.本文综述了目前AOB的分子生态学研究进展.主要介绍了AOB的种类和系统发育,基于16S rRNA的系统发育分析表明AOB的系统发育比较简单,均属于变形菌纲的β和γ亚纲.还介绍了目前研究AOB主要采用的分子生态学方法,如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、末端标记-限制性片段长度多态性(T-RFLP)、荧光原位杂交(FISH)和实时定量PCR(real-time PCR)等,总结了生态因子的改变对AOB群落结构和数量的影响,并对今后氨氧化细菌的应用分子生态学研究方向进行了展望.

污水处理工艺对氨氧化菌及细菌群落的影响

采用针对氨氧化菌(AOB)功能基因氨单加氧酶(amoA)的末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)、克隆测序等方法,研究了北京市2个污水处理厂的4个污水处理系统中AOB的群落结构,同时采用针对16SrRNA基因的T-RFLP技术分析了总细菌的群落结构.T-RFLP指纹图谱分析表明,4个污水处理系统中AOB的优势限制性片段(T-RF)均为291bp和354bp,细菌的优势T-RF为115,117,166,455,465,468,471,482,800,893bp等.说明污水处理工艺对系统中AOB及细菌的群落结构影响很小.对功能基因amoA的系统发育分析表明,4个污水处理系统中优势AOB均属于Nitrosomonas europaea cluster和Nitrosomonas oligotropha culster.

滇池沉积物中好氧氨氧化细菌群落多样性研究

从滇池沉积物中提取好氧氨氧化细菌(aerobic ammonium-oxidizing bacteria,AOB)的DNA,通过构建硝化作用氨单加氧酶基因(amo A)文库并划分操作分类单元(OTU)的方法,揭示好氧氨氧化细菌群落结构多样性。获得了80个amo A基因克隆,利用Mothur软件将相似度不小于97%的序列归为1个OTU,共得到22个OTUs,其中OTU1、OTU2、OTU3单元最大,分别包含了27、12、9条序列。对22个OTUs的代表序列进行系统发育分析表明,其序列都属于变形杆菌的β-亚纲,分布于亚硝化螺菌属、亚硝化弧菌属、亚硝化单胞菌属、亚硝化叶菌属4个属;优势种群为Nitrosomonas europaea的近缘种,尚未被描述过。

一株氨氧化菌的分离鉴定及其活性影响因子分析

从浙江舟山南美白对虾养殖池塘底泥样品中筛选到一株具有氨氧化功能的细菌,命名为AOB-1.菌株AOB-1好氧,革兰氏阴性,球状至短杆状;菌落呈淡黄色、干燥、针尖状.16S rDNA序列分析表明,该菌株与Nitrosomonas eutropha C91T的相似性为100%.氨氧化的关键酶--氨单加氧酶的基因(amoA)序列比对表明,该菌株与N.eutropha C91T的相似性为98%.在30℃,100r·min-1时,25～200mL培养基装量范围内装液量越少氨氧化率越高,最适pH值为8.氨氮浓度在1～200mg·L-1范围内,氨氧化速率随氨浓度的升高而加快;在200～1200mg·L-1范围内,氨氧化速率基本保持不变;但当氨氮浓度高达2000mg·L-1时,氨氧化活性受到明显抑制.菌株AOB-1不仅对养殖水体,而且对高浓度氨氮废水的处理也具有潜在的应用价值.

转iaaM基因高衣分棉花新种质材料创制

通过配制9个杂交组合,将iaaM基因转育到综合性状较优的棉花（Gossypium hirsutum L.）品系中.对F1与F2的分析,证实iaaM基因能够显著改良衣分和马克隆值,同时对子指、铃重、单株结铃数等产量性状和纤维长度、纤维强度等纤维品质未造成负面影响.通过系谱法选育获得6个衣分高、马克隆值优良的新品系,其衣分和马克隆值分别在43.23％～47.93％和3.76～4.20.试验为棉花育种改良提供了新的种质材料.

氨氧化古菌——环境微生物生态学研究的一个前沿热点

新近在环境基因组学研究上的突破和常温型泉古菌纯培养株系的获得揭示出氨氧化古菌(AOA)是一个不同寻常的功能类群.通过对氨氧化过程的关键酶之一氨单加氧酶(AMO)α亚基的编码基因(amoA)的系统发育分析发现,AOA是一个独立于氨氧化细菌(AOB)进化枝之外的进化类群.目前已确认,AOA是自然界中最丰富的氨氧化生物,其amoA基因的拷贝数最高可超过AOBamoA基因拷贝数3个数量级.在自然生态系统,尤其是海洋生态系统中具有十分重要的生态地位.据热力学估算,海洋AOA每年生成的NO2-与全球海洋新生产力(即海洋对大气碳封存)所需的N量相当;由AOA氧化海洋中的NH3获能所固定的CO2的总量远远超过了埋藏于全球海洋沉积物中的碳量.AOA已成为今后环境微生物生态学的研究热点之一.

珠江口海岸带沉积物氨氧化细菌和古菌组成及定量研究

[目的]对珠江口海岸带沉积物中的氨氧化细菌和古菌的组成进行分析,并进行定量研究。[方法]用构建克隆文库和Q-PCR定量的方法对珠江口沉积物中氨氧化细菌和古菌amoA基因的含量和多样性特征进行研究。[结果]在2个沉积物表层,氨氧化古菌的含量是细菌的9和22倍,揭示氨氧化古菌在珠江口的氨氧化过程中起主导作用;系统发育分析表明大多数古菌和细菌的amoA基因序列与不可培养的源于河口区和污染区域的环境克隆子序列有较高的同源性;细菌amoA序列可分成5个类群(Cluster A、B、C、D和E),均属于Nitrosomonas类群,其中Cluster A是主要类群(72.1%);古菌amoA序列分析表明来自于表层的序列有52.2%属于"水/沉积物"簇,47.8%属于"土壤/沉积物"簇,而沉积物底层厌氧区,检测到的古菌amoA基因93.3%属于"土壤/沉积物"簇,6.7%属于"水/沉积物"簇,且amoA基因数量略高于表层。[结论]该研究有助于了解珠江口区域氮的循环过程,为氮的富营养化处理提供重要的理论依据。

植物生长素合成酶iaaM基因在烟草韧皮部的特异表达对其发育的影响

为探讨生长素过度合成对植物韧皮部发育的影响,利用韧皮部特异表达的拟南芥蔗糖合成酶基因启动子与色氨酸单加氧酶基因(iaaM)重组,构建载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法将其转入烟草,获得了转化的烟草植株。大多转基因烟草都表现出叶片卷曲、植株生长异常的生长素过度表型。转基因烟草植株生长较野生型烟草(对照)植株明显迟缓,但其茎横切面韧皮部细胞显著增多,排列更加紧密整齐,木质部也较早开始分化。转基因烟草茎段有大量不定根分化,其根部则在韧皮部薄壁细胞处诱生大量根原基,在不定根上有大量侧根和根毛的分化。

南海北部陆坡表层沉积物氨氧化古菌多样性初探

基于南海北部陆坡不同深度梯度3个站位表层沉积物古菌氨单加氧酶基因(amo A)文库,对3个站位氨氧化古菌进行多样性和系统发育学分析。多种方法构建的系统发育树表明:3个站位所有的amo A基因序列都隶属于奇古菌门中Group I分枝内的Group I.1a系群,且各站位之间氨氧化古菌多样性没有明显的差异。501站位黑色砂质沉积物中古菌amo A基因与该站位的16S r RNA基因的系统发育比对显示:这2种基因标记的系统发育树整体上具有潜在的对应关系,说明对样品的氨氧化古菌多样性分析比较全面且可靠;并进一步暗示该样品中氨的硝化作用主要由奇古菌门下的Group I.1a系群来执行。由此可以推测:Group I.1a系群可能在南海北部表层沉积物中氮素的生物地球化学循环过程中扮演重要的角色。