基于稳定性同位素核酸探针技术的同化利用玉米秸秆碳微生物群落演替研究

[目的]研究秸秆分解过程中同化利用秸秆碳源的微生物生态演替过程,明确参与秸秆分解的主要微生物类群,为秸秆高效利用提供科学依据。[方法]采用^(13)C标记高丰度玉米秸秆。微宇宙室内培养试验的供试土壤为华北平原石灰性潮土。共设置3个处理:不添加秸秆(soil)、添加自然丰度秸秆(soil+^(12)C-straw)和添加13C标记秸秆(soil+^(13)C-straw)。培养30天时,结合同位素示踪与高通量测序等技术,测定秸秆添加对土壤有机碳的激发效应,分析利用秸秆碳源的细菌、真菌群落结构及其与土壤胞外酶活性的关系。[结果](1)秸秆添加显著提高了土壤CO^(2)排放,添加秸秆对土壤有机碳的激发效应在培养第1天达到峰值,土壤和秸秆CO^(2)排放比例均在培养第3天达到峰值。(2)整个培养时期共发现参与秸秆碳同化利用的细菌微生物操作分类单元(operational taxonomic units,OTU_(s))238个,真菌OTU_(s)24个。细菌OTU_(s)主要属于细菌变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)与绿弯菌门(Chloroflexi),真菌OTU_(s)主要为子囊菌门中的粪壳菌纲(Sordariomycetes)。(3)秸秆分解不同时期的微生物群落结构存在显著差异,在整个培养时期,以热单胞菌属(Thermomonas)与溶杆菌属(Lysobacter)为代表的7个细菌属快速响应秸秆添加,以假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)与土生单胞菌属(Terrimonas)为代表的6个细菌属延迟响应;两个真菌属枝鼻菌属(Cladorrhinum)与葡萄穗霉属(Stachybotrys)表现为对秸秆添加的快速响应,新赤壳属(Neocosmospora)与unclassified_f_Halosphaeriaceae为延迟响应。(4)曼特尔分析表明,细菌热单胞菌属(Thermomonas)、溶杆菌属(Lysobacter)、绿弯菌门(Chloroflexi)以及真菌裂壳菌属(Schizothecium)与碳氮转化相关土壤胞外酶活性呈显著正相关关系。[结论]外源秸秆添加对土壤有机碳产生正激发效应,显著增加了土壤CO^(2)排放。同化秸秆碳源的微生物随培养时间延长发生群落演替,细菌的热单胞菌属(Thermomonas)、溶杆菌属(Lysobacter)、绿弯菌门(Chloroflexi)以及真菌的裂壳菌属(Schizothecium)在玉米秸秆分解过程中具有重要作用,可为秸秆高效腐熟菌剂的研发提供依据。

稳定性同位素探针技术在土壤功能微生物原位鉴定的应用

新近发展起来的稳定性同位素探针技术(SIP)与分子生物学方法结合,能够定向发掘复杂环境中参与特定生态过程的微生物资源,是土壤功能微生物原位鉴定的有效手段,具有广阔的应用前景。其原理是环境样品中的功能微生物代谢同化同位素标记的底物,通过对其生物标志物(即DNA、RNA、PLFA等)进行提取、分离、鉴定和比对分析,以此获取介导土壤物质转化和循环过程的功能微生物的直接信息。本文在分别介绍SIP技术在土壤功能微生物原位鉴定过程中的各种前处理方法、生物标志物选择及后续鉴定方法的基础上,综述了SIP技术在研究驱动土壤有机污染物生物降解、碳氮循环等过程的功能微生物原位鉴定的应用进展,展望了SIP技术在土壤微生物基因组学方面的应用前景。

基于稳定性同位素核酸探针技术的红壤微生物底物利用策略研究

外源活性碳底物输入强烈影响土壤微生物的生长,但是在系统发育分类水平上,细菌和真菌对活性底物的动态响应及利用特征和微生物群落组成的关系仍不清楚。以红壤为研究对象,采用;C标记葡萄糖为底物进行模拟培养并定期取样,利用稳定性同位素核酸探针(DNA-based stable isotope probing,DNA-SIP)和高通量测序技术分析活性的真菌和细菌类群,并探讨不同微生物利用葡萄糖来源碳的动态特征。研究发现,微生物群落对葡萄糖的利用符合从细菌向真菌演替的r/K选择策略。在细菌群落中,隶属于富营养菌的变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)对活性底物的利用能力显著高于寡营养菌的酸杆菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)。和细菌的底物利用策略不同,真菌子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)在整个培养期间均可以利用葡萄糖和土壤原有组分。因此,葡萄糖的连续加入并未改变不同营养类型细菌的底物利用策略,而真菌对底物的利用具有广谱性特征,活性底物可诱导真菌对土壤原有组分的利用。

激光探针:稳定同位素分析的新式“武器”I:发展历史、工作原理和装置构成

激光探针：稳定同位素分析的新式“武器”＊Ｉ：发展历史、工作原理和装置构成肖益林郑永飞（中国科学技术大学地球与空间科学系，合肥２３００２６）关键词激光探针稳定同位素分析发展历史工作原理装置稳定同位素地球化学的发展与同位素分析方法的不断改进和完善密不可分...

激光探针稳定同位素分析技术的现状及发展前景

微区分析是同位素测试发展的重要方向。激光探针微区稳定同位素分析方法是同位素微区分析的重要手段。激光探针微区稳定同位素研究始于 2 0世纪 80年代 ,开始时主要集中于轻元素的稳定同位素研究。目前它已广泛用于碳酸盐碳、氧同位素 ,硫化物硫同位素 ,硅酸盐氧、硅同位素和氮同位素研究。近年来 ,多接收等离子质谱分析技术在重金属元素 (如铁、铜、锌、钼等 )的同位素分析方面取得迅速发展。因而 ,重金属元素的微区稳定同位素研究又成为当前的热点。文中对轻元素和重元素的激光探针微区稳定同位素分析的制样装置与设备 ,各种相关分析技术 ,以及在矿物、岩石与矿石研究中的应用现状进行了介绍。对激光探针微区稳定同位素分析技术的发展前景做了讨论。

激光探针——新的稳定同位素分析方法

简要地比较了ＣｌＦ３和ＢｒＦ５两种常规氟化法的优缺点。在此基础上介绍了激光氟化法（又称激光探针法）的主要构成和特点以及激光探针法的分析精度和分析不同矿物时的特点。激光探针法具有样品处理简单、用量少、速度快和可作原位分析等优点。激光探针法的使用为地幔氧同位素系统的研究勾画了一幅新的图景；在微区同位素分析。

激光探针:稳定同位素分析的新式“武器” Ⅱ.不同类型激光探针的分析流程与优缺点比较

激光探针：稳定同位素分析的新式“武器”Ⅱ．不同类型激光探针的分析流程与优缺点比较肖益林郑永飞（中国科学技术大学地球与空间科学系，合肥２３００２６）关键词激光探针稳定同位素分析分析流程优缺点１不同激光探针分析流程的比较１．１ＣＯ２激光探针的分析流程样品...

稳定同位素探针技术在环境微生态领域的应用

介绍了稳定同位素探针技术的概况,并对稳定同位素探针技术在环境微生态领域中的应用和其局限性进行了概述,为探索微生物种群结构和功能等微生态学研究提供了强有力手段。

厌氧消化污泥体系的DNA-稳定同位素探针标记条件研究

DNA稳定同位素探针(DNA stable-isotope probing,DNA-SIP)是鉴别复杂环境中功能微生物的有力工具。获得足够的标记^(13)C-DNA是该技术的关键,但^(13)C-DNA的富集受很多因素的影响。本研究以^(13)C-葡萄糖为底物,考察了不同条件(离心转速,底物投加量和污泥固含量)对厌氧消化污泥体系的DNA-SIP标记效果。结果显示:相对低的转速、高底物投加量及低污泥固含量有助于^(13)C-DNA的富集。对本研究的厌氧污泥,45400 rpm超高速离心40h(20℃),100 mg^(13)C-葡萄糖投加量,0.4%(w/w)污泥固含量可以获得较高的^(13)C-DNA丰度。该结果有助于指导厌氧消化体系中功能菌群的鉴定,进而促进对厌氧产甲烷机制的理解。

应用稳定同位素探针技术在多环芳烃环境行为与归宿研究新进展

多环芳烃（PAHs）由于其持久性、生物富集效应和＂三致＂作用,对人类健康和生态环境构成极大威胁。其中,高环PAHs的高生物毒性和低生物可利用性使其具有高残留和高风险的特点,其环境行为和自然衰减逐渐成为当前研究热点。微生物降解是环境PAHs自然衰减的重要途径,也是PAHs污染土壤的主要修复手段。现阶段PAHs降解微生物的研究主要针对低环PAHs,依靠传统分离培养技术,其环境降解和代谢途径已相对清晰。

稳定同位素探针技术结合宏基因组学在探究环境污染物微生物转化/降解过程中的应用进展

稳定同位素探针技术(SIP)结合宏基因组学在环境污染物微生物转化/降解研究中的应用已逐渐成为趋势.该组合技术不依赖纯培养方法,能够从复杂自然环境中鉴定出具有特定代谢功能的微生物类群,揭示污染物的微生物代谢途径,在研究污染物的原位微生物转化/降解过程方面具有显著优势.本文综述了该组合技术在探究不同环境介质中烃类化合物及其衍生物、有机农药、重金属和新型污染物微生物转化/降解过程中的应用进展,包括功能微生物的识别和污染物微生物转化/降解机制的解析等.最后,基于该组合技术的应用现状进行了展望,提出未来该组合技术与多种原位表征技术的联用将为微生物驱动污染物的转化/降解机制研究提供更准确全面的信息.

激光探针－质谱计联用测定稳定同位素

简要阐明激光探针－质谱仪系统是一种极有前途的分析仪器：在显微镜下选择分析部位，激光束聚焦到样品上使之气化，释放出待测同位素气体经纯化后输入质谱计测定。它将高的空间分辨力同精确、快速的同位素比值分析结合起来。常规的光斑１００～２００μｍ，有可能得到高得多的空间分辨力（２０μｍ），成为微区、原位测定稳定同位素的新技术。该技术可用于不易大量获取样品的年龄测定；测定在岩石样品中不同结构位置上填充的矿物年龄；测定矿物晶体中同位素的条带分布等，在构造年代学、变质岩年代学、矿床年代学研究方面发挥独特作用。

《激光探针微区稳定同位素分析方法及地质应用研究》主要进展

在国内首次自行建立激光探针微区氧、硅同位素分析系统；建立了激光氧、硅同位素分析方法，可测含氧量低至7个微克分子，含硅量可低至5微克分子，分析精度优于0．2‰，优于国际同类研究的先进水平；研制了石英玻璃和锰铝榴石两种激光氧、硅同位素分析标准物质，填补了国内外的空白；对伟晶岩、辉长岩、地幔包体等难熔矿物进行了微区氧、硅同位素变化研究，这些成果为激光同位素分析技术在国内的发展铺平了道路，为深入研究矿床成因、古气候、古环境开拓了新途径。该项目是地质调查项目。

稳定性同位素核酸探针技术DNA-SIP原理与应用

稳定性同位素核酸探针技术DNA-SIP(Stable isotope probing),是将复杂环境中微生物物种组成及其生理功能耦合分析的有力工具。微生物的体积在μm尺度,因此,自然环境中微生物群落在μm尺度下生理过程的发生、发展,其新陈代谢物质在环境中累积与消减的动力学变化规律,形成了微生物生理生态过程,决定了不同尺度下生态系统物质和能量的良性循环。利用稳定性同位素示踪复杂环境中微生物基因组DNA,实现了单一微生物生理过程研究向微生物群落生理生态研究的转变,能在更高更复杂的整体水平上定向发掘重要微生物资源,推动微生物生理生态学和生物技术开发应用。本文重点探讨了DNA-SIP的技术原理、主要技术瓶颈及对策,初步展望了DNA-SIP为基础的环境微生物基因组学发展趋势。

激光探针质谱研究新进展

激光探针质谱是最近发展起来的分析微量地质样品同位素和高空间分辨率的新方法。介绍了激光探针质谱的基本原理和实验装置，简述了国内外的研究进展及其在同位素地质年代学和稳定同位素地球化学方面的应用状况。

稳定同位素探针技术在有机污染物生物降解中的应用

稳定同位素探针技术(Stable isotope probing,SIP)是稳定同位素标记技术和各种分子生物学手段相结合的一系列技术总称。将其应用于探查污染物降解的功能微生物,实现了不经过分离培养直接把微生物的代谢功能、微生物间相互作用与微生物种群结合起来,从而克服了传统分离培养的缺陷,扩大了微生物资源的利用空间,具有广阔的发展前景。本文介绍了稳定同位素探针技术的基本原理和技术路线,对常规PLFA-SIP、DNA-SIP、RNA-SIP的特点进行了阐述和对比;综述了SIP在有机污染物——苯系物、多环芳烃、多氯联苯生物降解方面的研究进展,提出SIP应用于根际研究是今后该技术在生物降解研究中的一个发展方向。

N-氨基糖探针技术新用法:区分和量化土壤真菌和细菌固持无机氮速率

土壤微生物对无机氮的固持作用是构成土壤保氮机制的重要组成。作为土壤微生物的两大主要类群,真菌和细菌是微生物固持无机氮作用的主要参与者。然而,由于土壤微生物的高度复杂多变性,如何有效区分和量化土壤中真菌和细菌各自对无机氮的固持作用是个难题。针对该问题,本文采用"氨基糖稳定同位素探针(AS-SIP)"技术来区分和表征土壤中真菌、细菌各自对无机氮的固持速率。基于此进一步揭示了农业利用和外源碳输入分别对土壤真菌、细菌各自固持硝态氮作用的影响及原因,构建了土壤中真菌、细菌各自固持无机氮实际速率的估算模型,为区分和量化土壤中真菌、细菌各自对无机氮的实际固持速率提供了更为可信的新方法。本文介绍了AS-SIP技术原理、主要技术优势、应用案例、不足之处以及改进对策,以期推进该方法的应用和发展。

水稻土好氧甲烷氧化菌对大气CO_(2)浓度升高的适应规律

CH4是仅次于CO_(2)的第二大温室气体,而稻田是CH4的主要排放源,未来大气CO_(2)浓度升高情景下(elevatedCO_(2),eCO_(2)),水稻土好氧甲烷氧化过程及其功能微生物群落适应规律尚不清楚。依托中国FACE(FreeAir CO_(2) Enrichment)水稻田试验平台,通过13C-CH4示踪的室内微宇宙培养实验,采用稳定性同位素核酸探针(DNA-SIP)和高通量测序技术,研究未来大气CO_(2)浓度升高对水稻土甲烷氧化活性及其功能微生物的影响规律。结果表明:与常规大气CO_(2)浓度(ambient CO_(2),aCO_(2))相比,eCO_(2)条件下的甲烷氧化活性显著增加,从243 nmol·g^(-1) d.w.s·h^(-1)增加至302 nmol·g^(-1) d.w.s·h^(-1),增幅高达24.3%,甲烷氧化菌数量则增加了1.1倍~1.2倍。通过超高速离心获得活性甲烷氧化菌同化13CH4后合成的13C-DNA,高通量测序发现,未来大气CO_(2)升高情景下水稻土活性好氧甲烷氧化微生物群落极可能发生明显演替,与对照相比,类型I甲烷氧化菌甲基杆菌属Methylobacter的相对丰度增加16.2%~17.0%,而甲基八叠球菌属Methylosarcina的相对丰度下降4.7%~11.1%;同时刺激了食酸菌属Acidovorax和假单胞菌属Pseudomonas等非甲烷氧化菌的活性。综上所述:未来大气CO_(2)升高情景下,水稻土好氧甲烷氧化微生物群落结构发生分异,促进了甲烷氧化通量,而甲烷氧化的代谢产物可能引发土壤中微生物食物网的级联反应,是土壤碳储存和周转的重要功能微生物群。

伴矿景天对重金属-多环芳烃复合污染土壤有机污染物消减及微生物的影响

土壤重金属-有机物复合污染问题较为普遍,重金属超积累植物可通过吸收积累重金属至植株内,从而去除土壤中的重金属,但这类植物对复合污染土壤中有机污染物去除的影响尚不清楚,尤其是根际微生物在此过程中的作用机理仍然未知。基于此,探讨了镉-菲(Cadmium-Phenanthrene,Cd-PHE)复合污染土壤中,不同质量分数Cd处理下伴矿景天(Sedum plumbizincicola)对土壤中PHE生物消减的影响及其作用机理。对不同质量分数的土壤Cd影响下PHE的降解率、微生物群落组成、PHE潜在降解菌组成以及丰度进行分析,发现Cd会抑制PHE的降解,Cd添加量为10 mg·kg^(−1)时种植伴矿景天与不种植处理PHE的降解率分别降低了25.6%和13.3%。而伴矿景天在土壤Cd质量分数较低时则能显著促进Cd-PHE复合污染土壤中PHE的降解,其平均降解率较未种植物处理高出6.77%。同时提高了根际土壤中PHE潜在降解菌的丰度,其平均丰度较未种植处理高出0.538%。进一步结合SIP识别到的功能微生物分析发现,Cd的存在可通过降低以Micrococcaceae为代表的不耐受或具有低Cd耐受性的功能微生物的丰度,影响这类微生物对PHE的降解过程,从而不利于土壤中PHE的降解。而伴矿景天则能缓解Cd对PHE潜在降解菌的毒害,并通过在根际显著富集Micrococcaceae和Ellin6067等植物促生菌,提高这类特定PHE潜在降解菌的丰度,进而提高根际土壤中PHE降解菌的总丰度,促进土壤中PHE的降解。此外,通过DNA-SIP技术,还探查到Ellin6067、KD3-93、Flavisolibacter和Adhaeribacter为具有PHE潜在降解功能的微生物。该研究有望为耐重金属植物或重金属超积累植物在重金属-多环芳烃复合污染土壤修复领域的应用提供理论指导。

青枯病导病型和抑病型植烟土壤氮循环微生物群落差异分析

【目的】探明导病型和抑病型植烟土壤氮循环微生物群落演替规律,为研究连作障碍发生的微生物机制奠定基础。【方法】通过“限微模拟宇宙系统”,采用稳定同位素核酸探针(DNA-SIP)技术标记氮来源,利用宏基因组高通量测序技术开展导病抑病植烟根际土壤氮循环微生物特征分析,并建立特征微生物与烟叶品质、产质量、青枯病发病状况等表观数据的相关性。【结果】导病抑病土壤中参与氮素循环的微生物种类具有差异,导病与抑病土壤中受根系分泌物调控的特有微生物分别为受土壤本身影响微生物数量的63.9%和1.29倍;在根系分泌物介导下,导病土壤中与氮循环相关的物种群落主要为变形菌门(Proteobacteria),主要上调与细胞运动和转运有关的基因;抑病土壤中主要为放线菌门(Actinobacteria),主要上调与物质转运与代谢有关的基因。导病与抑病土氮循环微生物具有显著差异的物种为硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和木纹杆菌门(Lgnavibacteriae);抑病土壤中与质量指标间存在极显著相关关系的微生物属比导病土壤少21.7%,但抑病土壤微生物与烟叶品质关键指标茄酮间关联性是交叉互作的,显著相关比例较导病土提升19.3百分点。【结论】根系分泌物主要影响导病土壤与氮素循环相关的微生物,土壤本身的性状主要影响抑病土壤氮素循环相关微生物,即导病土壤微生物易受作物的影响发生病害;抑病土壤通过调控土壤微生物对烟叶质量的影响,保持烟叶质量的稳定状态。