脑氨基肽酶A抑制剂用于心血管疾病的研究进展

肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS)的过度激活在高血压、心力衰竭的发生发展中起着重要作用,研究表明,RAS系统的所有已知成分,包括血管紧张素肽、特定受体,以及代谢过程所需的酶已经在大脑中被确定。脑RAS系统参与高血压、心肌梗死后心力衰竭的调控。脑氨基肽酶A(Aminopeptidase A,APA)抑制剂能够抑制脑血管紧张素Ⅲ(AngiotensinⅢ,AngⅢ)的合成,可能是治疗顽固性高血压、防治急性心肌梗死后心力衰竭的新靶点。本文就相关研究进展进行综述。

敲除CRFK细胞氨基肽酶N对猫传染性腹膜炎病毒复制影响的研究

猫氨基肽酶N(fAPN)参与猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的感染过程,为研究f APN对FIPV复制的影响,本研究针对f APN第14外显子设计了1对sg RNA,将sg RNA退火后克隆至p X458质粒中,构建同时含有Cas9蛋白和sg RNA的重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,瞬时转染猫肾细胞(CRFK)中,24 h后通过流式细胞仪分选带有绿色荧光的单克隆细胞。单克隆细胞经稳定传代培养后,细胞中的绿色荧光消失,对细胞进行PCR和测序,结果显示:3株单克隆细胞在f APN第14外显子有1个碱基的插入,造成移码突变,导致f APN不能正常表达,表明敲除f APN蛋白的CRFK细胞系正确构建,命名为KO-APN14。将FIPV分别感染CRFK细胞及培养20代的KO-APN14细胞,48 h后通过间接免疫荧光试验(IFA)检测FIPV N蛋白的表达;将FIPV分别感染CRFK细胞及KO-APN14细胞,在感染4 h、12 h、24 h、36 h时采用RT-q PCR分别检测FIPV N基因、视黄酸(维甲酸)诱导基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、Toll样受体3(TLR3)、干扰素β(IFN-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)的转录水平。IFA结果显示:感染FIPV的CRFK细胞出现绿色荧光,未感染FIPV的CRFK细胞、未感染FIPV的KO-APN14细胞及感染FIPV的KO-APN14细胞均无绿色荧光;RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后病毒N基因的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够极显著抑制FIPV N基因的转录(P<0.0001);RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后上述各细胞因子的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够抑制RIG-I、MDA5、TLR3、IFN-β、IL-6、IL-10、TNF-α及f APN的转录。综上所述,f APN是FIPV在侵入细胞及病毒复制过程中发挥重要作用,并在FIPV引起的炎症反应过程中起关键作用。本研究为f APN在免疫炎症反应中作用的研究提供科学依据,并为培育基因编辑抗病育种猫奠定实验基础。

抗多房棘球蚴亮氨酸氨基肽酶纳米抗体筛选及原核表达纯化

目的筛选抗多房棘球蚴亮氨酸氨基肽酶(Em-LAP)纳米抗体并构建该纳米抗体原核表达系统,表达纯化纳米抗体蛋白,获得高特异性抗多房棘球蚴亮氨酸氨基肽酶的纳米抗体。方法利用噬菌体文库展示技术(phage library display technology)筛选亮氨酸氨基肽酶纳米抗体,应用phage-ELISA法检测纳米抗体与靶蛋白的亲和力。将亲和力高的抗体测序后,串联目的序列并优化密码子,合成后接入表达载体pET30a做酶切鉴定。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,表达的蛋白经金属螯合亲和层析纯化获得目的蛋白LAPNb。结果筛选出抗Em-LAP纳米抗体,构建了重组pET30a-LAPNb质粒,得到了一个大小约为28KD的LAPNb蛋白。结论本研究成功筛选获得了抗Em-LAP纳米抗体,构建了LAPNb原核表达系统,表达纯化了LAPNb蛋白。

肺炎克雷伯菌氨基肽酶A的克隆表达与活性鉴定

目的对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达,鉴定其酶活特性。方法根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence:NZ_CP045783.1)设计扩增引物,以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长,使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白,使用N^(2+)层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物,测定KP PepA对其水解能力,并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子,观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用t检验。结果扩增出长度为1527 bp的KP PepA基因,并获得可溶性KP PepA蛋白,大小为56.1×103,与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00)μmol/L比(8.00±2.00)μmol/L,t=63.36,P<0.01],表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37℃,最适pH值为pH 8.0。Co^(2+)、Mn^(2+)均可以提高KP PepA酶活性,其中Co^(2+)激活作用最强,加入Co^(2+)组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00,t=16.44,P<0.01);Zn^(2+)、Fe^(2+)均可以抑制KP PepA酶活性,其中Zn^(2+)抑制作用最强,加入Zn^(2+)组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00,t=8.49,P<0.01)。结论肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。

血浆氨基肽酶A水平与原发性高血压相关性分析

目的 探讨高血压人群血浆氨基肽酶A（APA）与原发性高血压的相关性.方法 对淮南市汉族人群进行问卷调查和血压、身高、体质量的测量,征集到高血压家系的高血压患者与血压正常者分别为131例与134例、非高血压家系的高血压患者与血压正常者分别为127例与132例为研究对象.分别应用RIA法和ELISA法测定研究对象的血浆血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）与APA水平.结果 两个家系中高血压组AngⅡ与APA水平显著高于非高血压组（t=10.3398,6.5613,11.7089,6.6683,均P＜0.01）.且高血压家系高血压组AngⅡ与APA水平显著高于非高血压家系的高血压组（t=3.6201,6.1091,均P＜0.01）.平均动脉血压与两个家系中高血压组AngⅡ水平与APA水平均呈显著正相关（非高血压家系r=0.315,0.392,均P＜0.05,高血压家系r=0.412,0.505,均P＜0.01）.高血压家系中高血压组血浆AngⅡ水平与APA水平呈正相关（r=0.322,P＜0.05）.结论 血浆APA水平在不同家系存在差异；高血压家系的高血压人群血浆APA水平显著升高,并与血压有一定的相关性.

血清甲胎蛋白、异常凝血酶原、γ-谷氨酰转肽酶与丙氨酸氨基转移酶比值变化对早期原发性肝癌患者疾病严重程度的影响

目的 探究早期原发性肝癌(PLC)患者血清甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)水平及γ-谷氨酰转肽酶与丙氨酸氨基转移酶比值(GGT/ALT)变化及其与疾病严重程度的关系,为临床PLC早期诊断和治疗提供参考依据。方法 回顾性分析2020年5月至2023年5月镇江市第三人民医院收治的70例存在肝功能异常患者的临床资料,根据疾病不同将其分为两组,PLC组(35例,为PLC患者)和肝炎组(35例,为慢性肝炎患者),另选取同期在本院进行健康体检人员35例的体检资料作为对照组。观察比较3组研究对象血清AFP、PIVKA-Ⅱ水平及GGT/ALT、阳性率,PLC组不同肿瘤直径患者上述指标水平。结果 与对照组比,肝炎组和PLC组患者血清AFP、PIVKA-Ⅱ水平及GGT/ALT及AFP、PIVKA-Ⅱ、GGT/ALT阳性率均呈逐渐升高趋势,且PLC组患者均较肝炎组、对照组更高,肝炎组患者血清PIVKA-Ⅱ水平高于对照组;与肿瘤直径<5 cm比,肿瘤直径≥5 cm的PLC组患者血清AFP、PIVKA-Ⅱ水平均更高(均P<0.05);不同肿瘤直径PLC组患者GGT/ALT比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 在早期PLC患者的诊断中,血清AFP、PIVKA-Ⅱ水平及GGT/ALT均较高,可为疾病诊治和后续治疗提供参考依据。

阶段梯度胶电泳分离血清甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶同工酶

阶段梯度胶电泳分离血清甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶同工酶肖明兵，张弘，姚登福，朱薇，黄介飞（南通医学院附院，江苏南通２２６００１）关键词甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶，同工酶，电泳，原发性肝癌，血清甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶（Ｇｌｙｃｙｌｏｒｏｌｉｎｅｄｉｐｅｐ...

亮氨酸氨基肽酶的临床应用进展

亮氨酸氨基肽酶（LAP）能水解肽链N端并由亮氨酸和其他氨基酸形成肽键的酶,广泛分布于肝、胰、肾等组织[1],当这些组织发生病变时,均可出现血清LAP升高。现就LAP的临床应用进展情况进行综述。

甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的方法学研究

本文研究了甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(GPDA)的最佳测定条件。最适pH8.6,Km 值为1.91±0.08mmol/L,选用158mmol/L Tris、64mmol/L 双甘氨肽、10 mmol/L 底物。酶促反应速度在70分钟内呈线性,酶活力在600U/L 内呈线性。高、中,低活力标本批内变异1.7～3.1%,批问变异3.8～6.7%,标本置4℃一周,结果无明显变化。168例健康者GPDA 为150.1±49.8(2SD)U/L,同时研究了测定管、底物空白、对硝基苯胺的光学吸收特性,观察了GPA 试剂在不同pH 和不同时间的变化规律。

棉铃虫中肠氨基氨肽酶N基因的克隆及序列分析

通过简并引物PCR结合RACE技术 ,从棉铃虫中肠中克隆了 1个氨基氨肽酶N基因 ,该基因全长 30 4 3bp ,阅读框包括 2 85 6bp ,编码 95 1个氨基酸。预测蛋白分子量为 10 8.3kD ,等电点为 5 .2 9。序列中具有谷氨酸锌化氨肽酶的保守结构GAMEN以及锌结合位点HEXXHX18E。N 末端 2 0个氨基酸具有信号肽的特征 ,C 末端 2 5个氨基酸具有明显的亲脂性 ,并且具有跨膜特征。该基因已经在GenBank中登记 ,序列号为 :AY1810 2 6。

甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定及其应用

本文介绍速率法测定血清甘氨酰脑氨酸二肽氨基肽酶(Glycylprolinc dipcptidylaminopeptidase,GPDA)的方法.并应用于自动生化分析仪,测定的最适pH 为8.6,酶活力在1300 U/L 以下成线性,三份高、中、低值酶活力标本批内CV 0.7%～1.4%,批间CV1.2%～4.4%.132例正常人GPDA 为185.2±28.6((?)±s)U/L,65例原发性肝癌组为408.0±216.1 U/L((?)±s),明显高于正常组(p<0.001),且与AFP 水平无相关意义(r=0.0361),24例胃癌和18例肺癌,分别为99.5±16.6 U/L 和111.8±23.0U/L 明显低于正常组(p<0.001),并发现GPDA 在食道癌及贲门癌病人亦有下降趋势(p<0.01)。

异常妊娠孕妇血清亮氨酸氨基肽酶活性检测的价值

目的探讨孕妇血清亮氨酸氨基肽酶（LAP）检测在异常妊娠中的临床价值。方法分别检测早期妊娠（4-13周,其中宫外孕34例、正常妊娠34例）、中期妊娠（13-28周,其中先兆流产32例、正常妊娠51例）、晚期妊娠（28-41周,其中子痫前期39例、肝内胆汁淤积症30例、多胎妊娠30例、正常妊娠54例）妇女血清LAP、碱性磷酸酶（ALP）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性并做比较。结果早期妊娠中宫外孕组LAP活性明显低于正常妊娠组（P〈0.05）,ALP和ALT活性2组间差异无统计学意义（P〉0.05）。中期妊娠中先兆流产组血清LAP、ALP、ALT与正常妊娠组比较差异均无统计学意义（P〉0.05）。晚期妊娠中子痫前期组LAP活性虽高于正常妊娠组,但差异无统计学意义（P〉0.05）,而肝内胆汁淤积症组和多胎妊娠组LAP、ALP和ALT活性均明显高于正常妊娠组（P〈0.05）。结论连续测定LAP活性可监测妊娠过程中有无异常,对监测胎盘功能及妊娠并发症具有一定的意义。

瑞舒伐他汀联合羟苯磺酸钙治疗老年糖尿病肾病的效果及对尿亮氨酸氨基肽酶、足细胞标志蛋白水平的影响

目的探讨瑞舒伐他汀联合羟苯磺酸钙对老年糖尿病肾病的效果及对尿亮氨酸氨基肽酶(LAP)、足细胞标志蛋白(PCX)水平的影响。方法选取82例糖尿病肾病患者,根据随机数字法分为观察组和对照组,每组41例。对照组使用常规方案联合瑞舒伐他汀治疗,观察组在此基础上联合羟苯磺酸钙治疗。比较两组临床疗效、尿LAP、PCX、血糖、肾功能指标、尿蛋白指标及负面情绪生活质量的变化。结果治疗后,观察组临床总有效率显著高于对照组(P<0. 05)。观察组的尿LAP、PCX及糖化血红蛋白(HbA1c)、餐后2 h血糖(2 h BG)、空腹血糖(FPG)水平显著低于对照组(P<0. 05)。观察组的肾小球滤过率(GFR)水平显著高于对照组(P<0. 05),尿微量白蛋白(Umalb)、血肌酐(Scr)水平显著低于对照组(P<0. 05)。观察组的焦虑评分、抑郁评分显著低于对照组(P<0. 05),生活质量评分显著高于对照组(P<0. 05)。结论瑞舒伐他汀联合羟苯磺酸钙能有效降低老年糖尿病肾病患者尿LAP、PCX水平,临床疗效良好。

血清氨基肽酶N(APN/CD13)水平与类风湿性关节炎患者骨破坏相关

目的评价血清氨基肽酶N(APN/CD13)水平对类风湿性关节炎(RA)患者骨破坏影响和监测意义。方法将RA患者分为有骨质破坏组和无骨质破坏组,采用ELISA检测各组血清APN水平及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素17(IL-17)水平。通过独立样本T检验比较两组RA患者血清APN、细胞因子水平差异,皮尔逊相关分析细胞因子和APN水平的相关性。结果有骨质破坏的RA患者,其血清APN水平高于无骨质破坏的RA患者,并且随着RA患者双手正位片的分级,血清APN水平增高。以APN血清含量作为RA骨破坏的预测指标,与类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体进行对比,APN的约登指数高于RF、抗CCP抗体的约登指数。RA患者的血清APN含量和TNF-α水平呈正相关。结论 RA患者的血清APN水平与其骨破坏程度存在相关性。

肝素对亮氨酸氨基肽酶测定的干扰评价

目的依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP7-A2文件评价肝素对速率法测定亮氨酸氨基肽酶(LAP)的干扰,明确干扰物质带来的结果差异,确保分析方法性能符合临床要求。方法首先,使用2个不同厂家[北京利德曼生化股份有限公司(简称利德曼)、日本第一化学药品株氏会社(简称日本一化)]的试剂同时测定40例患者不抗凝血样本和肝素锂抗凝血样本的LAP,对2种样本的LAP结果进行分析,对有差异的结果进行干扰筛选分析。然后,分别进行"配对差异"试验和"剂量效应"试验以及肝素干扰LAP测定的浓度范围的评价。结果利德曼试剂测定2种样本LAP的结果有差异(P<0.05),日本一化试剂结果无差异(P>0.05)。"配对差异"试验显示肝素对利德曼试剂测定低浓度LAP时存在干扰,而高浓度LAP不存在干扰。"剂量效应"试验结果显示肝素在不同浓度对LAP测定的干扰为非线性函数。初步判定LAP≤97 U/L时,肝素对利德曼试剂产生干扰;在LAP≥149 U/L时,其干扰效应不明显。结论当样本LAP≤97 U/L时,用利德曼试剂测定肝素锂抗凝样本LAP时会对检测结果产生正干扰。为保证LAP检测结果的准确性,如果继续使用利德曼LAP试剂,则需换用无抗凝的干燥管采集样本;如果继续使用肝素锂抗凝管采集样本,可换用日本一化LAP试剂。

冠状病毒的氨基肽酶N受体的研究进展

氨基肽酶N(Aminopeptidase N,APN)是一种锌离子依赖性膜结合II型的金属跨膜糖蛋白,其广泛存在于人和哺乳动物的多种组织细胞中。APN是多种冠状病毒的黏附性受体,参与冠状病毒的粘附与侵袭,与病毒感染密切相关。本文对多种冠状病毒(HCoV-229E、FCoV、CCoV、TGEV、PEDV)的APN受体的结构、功能、抑制剂等研究进展进行了总结,重点介绍了其作为人和猪冠状病毒功能受体的进展。本文为深入研究和应用冠状病毒APN受体提供参考。

亮氨酸氨基肽酶和甲胎蛋白联合检测肝癌的临床价值

目的探讨血清亮氨酸氨基肽酶(LAP)、甲胎蛋白(AFP)在肝癌诊断和介入治疗中的临床应用价值。方法对2011年6月至2013年8月在本院体检健康者102例和肝癌患者78例采用罗氏P800全自动生化分析仪测定其血清LAP、AFP水平。结果肝癌组血清LAP、AFP显著高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两种标志物的联合检测阳性率达91.0%,较LAP、AFP单项检测时有明显提高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LAP、AFP在肝癌的诊断和介入治疗的效果监测方面有一定应用价值,联合检测可提高肝癌的阳性诊断率。

血清丙氨酸氨基肽酶和亮氨酸氨基肽酶的临床应用

目的 探讨血清丙氨酸氨基肽酶(AAP)和亮氨酸氨基肽酶(LAP)在肝胆疾病诊断中的应用价值。方法 采用速率法同时检测159例肝胆疾病患者血清AAP、LAP活性。结果 各种肝胆疾病患者血清AAP、LAP活性多有不同程度升高,升高幅度依次为:急性胆道疾病>原发性肝癌>急性黄疸性肝炎>肝硬化>转移性肝癌>慢性乙型肝炎,两者显著相关,相关系数r为0.976 2,P<0.01。与常见的三种肝酶ALT、ALP、GGT相比,AAP、LAP与ALP、GGT呈正相关,与ALT没有相关关系。结论 AAP和LAP在肝胆疾病诊断中的临床意义十分相似,为鉴别肝胆疾病类型提供了新的、有效的诊断依据。

黄芪联合缬沙坦治疗糖尿病肾病及对尿亮氨酸氨基肽酶、足细胞标志蛋白水平的影响

目的 探讨黄芪联合缬沙坦治疗糖尿病肾病（DN）的临床疗效及对尿亮氨酸氨基肽酶（LAP）和足细胞标志蛋白（PCX）水平的影响。方法 选取2014年5月-2015年5月该院收治的74例DN患者为研究对象,随机分为对照组37例和黄芪治疗组37例,对照组接受糖尿病的常规治疗,并口服缬沙坦,黄芪治疗组在对照组的基础上应用中药黄芪注射液,比较两组的临床治疗效果及尿LAP、PCX水平。结果 黄芪治疗组的总有效率为86.5%,高于对照组的总有效率64.9%（χ~2=4.702,P0.05）;黄芪治疗组患者接受黄芪注射液与缬沙坦联合治疗后LAP和PCX水平较治疗前均下降（t=7.694和9.312,P〈0.01）。接受不同治疗后两组患者LAP和PCX水平比较,差异有统计学意义（t=7.803和5.693,P〈0.01）。结论 黄芪联合缬沙坦治疗糖尿病肾病效果较好,可有效降低患者尿LAP和PCX水平,明显改善患者临床症状,值得临床推广应用。

中晚期孕妇血清亮氨酸氨基肽酶水平及其临床意义

目的探讨中晚期孕妇血清亮氨酸氨基肽酶(LAP)的变化水平及其临床意义。方法采用速率法分别检测175例中期妊娠(162例为正常妊娠)妇女、302例晚期妊娠(215例为正常妊娠)妇女及100例健康未孕妇女的血清LAP水平。结果正常中期妊娠组血清LAP活性为(140.43±64.39)U/L,正常晚期妊娠组为(234.72±93.53)U/L,对照组为(72.62±15.31)U/L,前两组的LAP活性显著高于对照组(P<0.05)。当妊娠合并肝内胆汁淤积(ICP)时,均较相应正常妊娠组LAP活性显著增高。结论正常妊娠随着孕周的增加,血清LAP活性随之升高,但如合并ICP时升高更为显著。妊娠高血压综合征时LAP轻微升高,早产时略有降低。LAP水平的变化可作为妊娠合并ICP及孕妇和胎儿健康情况动态监测的一项有效指标。