甲氧基聚乙二醇-1,2-二硬脂酰甘油磷酰乙醇胺的合成

以1,2-二硬脂酸甘油酯为原料,依次与三氯氧磷和乙醇胺反应,得到1,2-二硬脂酰甘油磷酰乙醇胺(DSPE),其在N,N’-羰基二咪唑作用下与甲氧基聚乙二醇(mPEG2000)反应,生成甲氧基聚乙二醇2000-1,2-二硬脂酰甘油磷酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)。产物结构经过红外光谱、质谱及核磁氢谱等表征确证。

高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定盐酸多柔比星脂质体注射液中聚氧乙烯二硬脂酰磷脂酰乙醇胺与氢化大豆磷脂酰胆碱的含量

目的本实验主要建立了采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)测定盐酸多柔比星脂质体注射液中聚氧乙烯二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG-DSPE)与氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)含量的分析方法 ,此外还对新型检测器-电喷雾检测器进行了研究和探讨。方法采用Waters Symmetry 300 C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm;孔径:300),以甲醇-四氢呋喃-0.17 mol·L-1乙酸铵(93∶6∶1)为流动相,流速为1.0 m L·min-1,柱温为25℃,进样量为10μL;Alltech 2000ES型ELSD检测器漂移管温度为110℃,载气流速为2.6 L·min-1。结果该法具有较好的专属性;聚氧乙烯二硬脂酰磷脂酰乙醇胺在0.03~0.48 mg·m L-1(r=0.999 8)内校正曲线(lg A^lg C)的线性关系良好,氢化大豆磷脂酰胆碱在0.1~1.0 mg·m L-1(r=0.999 8)内校正曲线(lg A^lg C)的线性关系良好;聚氧乙烯二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的平均回收率约为100.0%(n=3×3),氢化大豆磷脂酰胆碱的平均回收率约为101.0%(n=3×3);聚氧乙烯二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和氢化大豆磷脂酰胆碱的最低检出限分别为13和52 ng;聚氧乙烯二硬脂酰磷脂酰乙醇胺重复性和中间精密度分别为0.9%(n=5)和≤1.9%(n=3),氢化大豆磷脂酰胆碱重复性和中间精密度分别为1.1%(n=5)和≤1.3%(n=3)。结论该方法准确、可靠,重复性好,可用于盐酸多柔比星脂质体注射液中聚氧乙烯二硬脂酰磷脂酰乙醇胺与氢化大豆磷脂酰胆碱的含量测定。

DSPE-mPEG2000修饰荷叶碱脂质体制备及其体内药动学研究

目的制备二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2000)修饰荷叶碱脂质体,并考察其体内药动学。方法薄膜超声法制备脂质体。以磷脂酰胆碱与胆固醇比例、脂药比、DSPE-mPEG2000用量、水化温度、超声时间为影响因素,单因素试验优化处方,测定包封率、载药量、粒径、PDI、Zeta电位、体外释药。18只大鼠随机分为3组,分别灌胃给予荷叶碱原料药、不含DSPE-mPEG2000荷叶碱脂质体、DSPE-mPEG2000修饰荷叶碱脂质体的0.5%CMC-Na混悬液(20 mg/kg),于0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h采血,HPLC-MS/MS法测定荷叶碱血药浓度,计算主要药动学参数。结果最佳处方为荷叶碱用量20 mg,磷脂酰胆碱与胆固醇比例5∶1,脂药比12∶1,DSPE-mPEG2000用量30 mg,水化温度40℃,超声时间15 min,平均包封率为71.69%,载药量为4.59%,粒径为161.84 nm,PDI为0.163,Zeta电位为-7.17 mV。DSPE-mPEG2000修饰后,荷叶碱在人工胃液、人工肠液中48 h内累积释放度分别为66.17%、53.90%。与原料药比较,脂质体t_(max)、t_(1/2)延长(P<0.01),C_(max)、AUC_(0~t)、AUC_(0~∞)升高(P<0.01),相对生物利用度增加至6.14倍。结论DSPE-mPEG2000修饰脂质体可促进荷叶碱口服吸收。

HPLC-电雾式检测器(CAD)检测法测定脂质体中磷脂含量

目的建立HPLC-电雾式检测器(Charged Aerosol Detection,CAD)检测脂质体磷脂含量及降解产物的方法。方法选用几种类脂材料制备成空白脂质体注射剂及冻干粉针剂,利用HPLC-CAD测定脂质体磷脂膜中各种类脂的含量,采用反相C8色谱柱,流动相为甲醇-水,梯度洗脱,流速1 mL.min-1。结果4种类脂材料的平均回收率分别为99.2%,98.7%,99.5%,99.1%;RSD分别为1.1%,1.5%,0.8%,1.3%。结论实验充分证明了HPLC-电雾式检测器联合应用,可以快速、高效、准确地检测脂质体中的磷脂含量及杂质。

DSPE-PEG 2000 maleimide的合成

目的研究长循环靶向型脂质体中间体二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(phosphatidyl ethanolamine-polyethylene glycol-maleimide,DSPE-PEG 2000 maleimide)的新合成方法。方法用β-氨基丙酸和马来酸酐作为原料,合成中间体2;以聚乙二醇2000(PEG 2000)为原料合成关键中间体8;用(S)-(+)-甘油醇缩丙酮为起始原料合成DSPE;中间体8与DSPE对接,得到目标化合物。结果与结论目标化合物的结构经1H-NM R确证。该路线操作简便、条件温和,可以作为生产工艺研究的参考。

聚乙二醇磷脂包裹的聚乳酸羟基乙酸微球防止肺泡巨噬细胞吞噬

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(polylactic acid-glycolic acid,PLGA)微球体系在肺部缓控释递药系统中具有独特优势。然而,肺巨噬细胞的吞噬清除极大地限制了药物在肺深部的长期滞留。为规避肺巨噬细胞清除作用,本文设计了一种经聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(polyethylene glycol-distearoyl-glycero-phosphoethanolamine,PEG-DSPE)包裹的PLGA微球,并探究了PEG-DSPE链长及比例对巨噬细胞摄取的影响。以香豆素-6为荧光探针,经膜乳化联合溶剂挥发法制备了各PLGA微球制剂,粒径控制为3~5μm、包封产率大于90%。在细胞液中孵育48 h后,荧光素体外泄漏量低于1.5%,排除了游离荧光素对细胞摄取的干扰。选用鼠源性巨噬细胞RAW264.7进行体外细胞实验。细胞毒性实验表明各制剂对细胞均无毒性。细胞摄取实验结果显示,与未包裹制剂相比,高低比例(PEG-DSPE/PLGA 1∶1、0.25∶1) PEG5000-DSPE、PEG10000-DSPE包裹均可显著减弱巨噬细胞对粒子的吞噬作用。对于PEG2000-DSPE包裹微球,可通过增加PEG在粒子表面的比例达到逃逸巨噬细胞吞噬的效果。综上,PEG-DSPE链长及比例是影响巨噬细胞摄取的关键因素,在肺部缓控释递药系统中,可通过选用高分子量PEG-DSPE (PEG5000-DSPE、PEG10000-DSPE)或高比例(PEG-DSPE/PLGA 1∶1)的PEG2000-DSPE包裹微球,达到逃逸肺巨噬细胞吞噬、延长药物肺内滞留的效果。

聚乙二醇对盐酸伊立替康脂质体体外释放及在不同稀释介质中稳定性的影响

目的:考察不同聚乙二醇含量对盐酸伊立替康脂质体体外释放特性及在不同稀释介质中稳定性的影响。方法:采用乙二胺四乙酸铵梯度法,以聚乙二醇2000含量分别为0、8、14、20、26 mg/ml的聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(m PEG2000-DSPE)制备盐酸伊立替康脂质体,测定其包封率和粒径,评价其体外24 h内的累积释放度和在生理氯化钠溶液与5%葡萄糖注射液中的稳定性。结果:随着m PEG2000-DSPE含量的增加,盐酸伊立替康脂质体体外24 h累积释放度逐渐减小;以生理氯化钠溶液及5%葡萄糖注射液稀释后,随着m PEG2000-DSPE含量的增加,盐酸伊立替康脂质体的包封率和粒径变化均减小;当聚乙二醇2000质量浓度增加至20、26 mg/ml时,脂质体包封率和粒径基本不再变化。结论:m PEG2000-DSPE的加入可减慢盐酸伊立替康脂质体的体外释放,提高其在不同稀释介质中的稳定性。

去甲斑蝥素纳米胶束的制备及抑瘤作用研究

目的:制备去甲斑蝥素纳米胶束,并研究其抑瘤作用。方法:采用三嵌段共聚物二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺在水中自组装形成去甲斑蝥素纳米胶束。观察所制纳米胶束形态,考察其载药率、包封率、粒径和Zeta电位。通过MTT法考察阴性对照组(磷酸盐缓冲液)、载体组(空白纳米胶束)、阳性对照组(去甲斑蝥素原料药,5~320μg/m L)和去甲斑蝥素纳米胶束组(以去甲斑蝥素计,5~320μg/m L)人肺癌A549细胞在作用不同时间(24、48、72 h)后的细胞生存率。将荷瘤裸鼠随机分为空白对照组、去甲斑蝥素注射液组(1 mg/kg)和去甲斑蝥素纳米胶束低、高剂量组(0.5、1 mg/kg),每组6只,每天尾iv相应药物1次,连续8周;每周测量肿瘤的大小,给药结束后第2天检测瘤质量。结果:去甲斑蝥素纳米胶束呈圆球状,载药率为(2.82±0.05)%,包封率为(83.67±1.78)%,粒径为(138.6±45.8)nm,Zeta电位为-(12.75±0.34)m V(n=6);载体组A549细胞生存率无明显变化,阳性对照组和去甲斑蝥素纳米胶束组A549细胞生存率明显降低,与浓度和时间呈正相关,且去甲斑蝥素纳米胶束组细胞生存率降低程度较阳性对照组更明显(P<0.01)。与空白对照组比较,3个给药组裸鼠的瘤质量均减小(P<0.05),其中去甲斑蝥素纳米胶束高剂量组减小程度较去甲斑蝥素注射液组更明显(P<0.05)。结论:成功制得去甲斑蝥素纳米胶束,其对A549细胞具有较好的体内外抑瘤作用。

荷载Akt基因的PEG-PLGA/DOPE纳米粒的制备及对大鼠缺血性脑损伤的影响

目的探讨荷载Akt基因的聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物/二油酰磷脂酰乙醇胺(PEG-PLGA/DOPE)纳米粒(Akt-NPs)对脑缺血-再灌注(I-R)诱导的大鼠海马CA1区神经细胞损伤及血红素加氧酶1(HO-1)、半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达的影响。方法通过复乳法制备PEG-PLGA/DOPE纳米粒并对其进行表征。将48只SD大鼠随机均分为假手术组(A组)、全脑I-R组(B组)、I-R+Akt-NPs组(C组)和I-R+空载PEG-PLGA/DOPE纳米粒组(D组)。采用焦油紫染色和TUNEL染色检测全脑I-R后5d各组大鼠海马CA1区神经细胞凋亡的情况,免疫印迹法检测各组HO-1和Caspase-3的表达。结果制备的纳米粒能够较好地荷载Akt基因。I-R后5d时,与A组相比,B组大鼠脑海马CA1区神经细胞凋亡率上升(P<0.05),HO-1表达减少(P<0.05),Caspase-3表达增加(P<0.05);与B组相比,C组大鼠脑海马CA1区神经细胞凋亡率下降(P<0.05),HO-1表达增加(P<0.05),Caspase-3表达减少(P<0.05)。结论 Akt-NPs减轻大鼠海马CA1区神经细胞的缺血性损伤作用与上调HO-1和下调Caspase-3表达有关。

基于叶酸表面修饰的蓝萼甲素长循环脂质体的制备与药效学评价

目的制备叶酸-聚乙二醇2000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(FA-PEG2000-DSPE)表面修饰的蓝萼甲素长循环脂质体,并评价其对人宫颈癌Hela细胞的体内外抗肿瘤活性。方法采用薄膜分散-挤出法分别制备蓝萼甲素长循环脂质体(GLA-Lips)和经FA-PEG2000-DSPE修饰的蓝萼甲素长循环脂(FA-GLA-Lips),通过透射电镜观察GLA-Lips和FA-GLA-Lips的微观形态,马尔文激光粒度仪测定了两种脂质体的粒径分布以及ζ电位,采用反向透析法考察了GLA-Lips和FA-GLA-Lips在磷酸盐缓冲液(pH7.4)和大鼠血浆中的药物释放情况;比较了蓝萼甲素原料药、GLA-Lips和FA-GLA-Lips在体外和体内对人宫颈癌Hela细胞的抗肿瘤效果。结果透射电镜下可观察到GLA-Lips和FA-GLA-Lips均呈类球状分布,平均粒径分别为(93.5±2.1)nm和(89.4±3.7)nm,ζ电位分别为(-12.4±0.6)mV和(-11.2±0.7)mV;GLA-Lips和FA-GLA-Lips在磷酸盐缓冲液中药物释放缓慢,而在大鼠血浆药物释放速率提高;体外实验结果显示GLA-Lips和FA-GLALips对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用均高于蓝萼甲素原料药,裸鼠体内实验结果显示FA-GLALips抑制人宫颈癌Hela细胞生长速度高于GLA-Lips。结论本研究制备的叶酸表面修饰蓝萼甲素长循环脂质体对人宫颈癌Hela细胞具有较强的抑制效果,具有一定的靶向性。

麦醇溶蛋白-雷帕霉素复合纳米颗粒治疗乳糜泻的探索研究

目的设计制备搭载麦醇溶蛋白(Gliadin)-雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)的复合纳米颗粒,经结构表征、稳定性、缓释特性等研究优选处方,测试其对乳糜泻相关过敏反应的免疫耐受治疗作用。方法本研究利用沉淀自组装法制备聚合物脂质杂化纳米粒(PLNs),载药后超滤离心法得到浓缩纳米药物水溶液;透射电镜观察其形态;激光粒度分析仪考察粒径、Zeta电位和稳定性;BCA蛋白定量测试及分光光度计考察包封率;透析袋法考察其体外释药特性;迟发超敏反应考察其免疫抑制效应。结果制备的PLN ^(Gliadin)、PLN^(Rapa)及PLN^(Gliadin+Rapa)纳米粒形态规整,分布良好,粒径分别为(198.04±10.98)nm、(70.73±6.51)nm、(200.98±0.77)nm;Zeta电位分别为(-29.71±5.67)mV、(-41.55±1.13)mV、(-44.80±4.93)mV;PLN ^(Gliadin)及PLN^(Gliadin+Rapa)的Gliadin包封率分别为(43.05±3.35)%与(41.79±4.93)%;PLN ^(Rapa)及PLN^(Gliadin+Rapa)的Rapa包封率分别为(38.05±6.26)%和(26.13±1.30)%。三种PLNs纳米药物缓释特性明显;药效学试验结果表明三种PLNs纳米药物均能降低由Gliadin刺激造成的足底肿胀超敏反应,PLN^(Gliadin+Rapa)效果最显著,且两次预防治疗比单次预防治疗效果好。结论搭载Gliadin-Rapa的PLNs递送体系结构稳定,缓释作用突出,能有效抑制乳糜泻相关的过敏反应,是治疗乳糜泻的潜在方法。

靶向性蒿甲醚脂质体的构建及体外靶向性研究

目的构建靶向性蒿甲醚脂质体并评价其对C6脑胶质瘤细胞的体外靶向性。方法以氨基蝶呤(APGA)为靶向性分子,采用化学法合成靶向性功能材料氨基蝶呤-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺共聚物(APGA-PEG2000-DSPE),以薄膜分散法制备靶向性蒿甲醚脂质体,构建血脑屏障(BBB)-C6脑胶质瘤肿瘤球共培养模型,以香豆素为荧光探针,以共聚焦荧光显微镜观察靶向性脂质体跨越BBB及穿透肿瘤球的能力,以流式细胞仪检测C6细胞对脂质体的摄取情况来评价制剂的靶向性能,采用SRB法考察靶向性脂质体对C6脑胶质瘤细胞的生长抑制作用。结果合成的APGA-PEG2000-DSPE的相对分子质量为3 150,与预测的相对分子质量相吻合;共培养模型显示靶向性脂质体可以更好地跨越BBB并穿透肿瘤球,对于C6脑胶质瘤细胞,靶向性蒿甲醚脂质体、蒿甲醚脂质体、游离蒿甲醚对C6脑胶质瘤细胞的IC50值分别为42、82、95μmol/L。结论构建的靶向性蒿甲醚脂质体可以有效跨越BBB,并靶向运输至脑胶质瘤肿瘤球内部,且具有很强的杀伤脑胶质瘤细胞活性。

依托泊苷长循环亚微乳的制备和理化性质研究

目的制备依托泊苷长循环亚微乳,并对其进行理化性质研究。方法在依托泊苷亚微乳处方的基础上,通过考察乳粒表面固有水化层厚度与聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)用量的关系,确定PEG2000-DSPE用量,从而确定了依托泊苷长循环亚微乳的处方和制备工艺,并进行了理化性质研究。结果依托泊苷长循环亚微乳的浓度为0.8mg/mL,平均粒径为(185.4±5.7)nm,Zeta电位为(?51.6±0.8)mV,药物包封率为97.52%。结论得到了包封率在95%以上的依托泊苷浓度为0.8mg/mL的依托泊苷长循环亚微乳的处方和制备工艺。